p8蛋白在二氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：二氫青蒿素(DHA)是青蒿素類藥物的主要活性代謝產(chǎn)物，是臨床上應(yīng)用多年、安全有效的抗瘧藥物。近年來很多研究表明DHA在多種腫瘤模型中表現(xiàn)出良好的抑制腫瘤作用，但是臨床試驗(yàn)表明單獨(dú)使用二氫青蒿素不能達(dá)到理想的治療腫瘤效果。應(yīng)激相關(guān)蛋白p8自發(fā)現(xiàn)以來多次被證明與腫瘤發(fā)生和耐藥相關(guān)，并且前期研究我們發(fā)現(xiàn)DHA作用后p8的上調(diào)降低了腫瘤細(xì)胞對DHA的敏感性。因此本文針對p8上調(diào)引起腫瘤細(xì)胞對DHA耐藥的機(jī)制進(jìn)行探究，為提高DHA抗腫瘤治療

2、提供新思路。
　　方法：選用人宮頸癌HeLa細(xì)胞，結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞，探討p8上調(diào)引起腫瘤細(xì)胞對DHA耐藥的分子機(jī)制。(1)運(yùn)用Western Blot檢測p8、 ATF4、 CHOP、 caspase3、PARP、LC3等蛋白表達(dá)水平(2)運(yùn)用RT-PCR檢測p8、ATF4、CHOP的mRNA水平。(3)運(yùn)用磺基羅丹明B(SRB)染色法檢測藥物對細(xì)胞的抑制率。(4)運(yùn)用siRNA技術(shù)沉默細(xì)胞內(nèi)p8、 ATF4、 CHOP和A

3、tg5的表達(dá)。(5)運(yùn)用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)將細(xì)胞內(nèi)p8過表達(dá)。(6)使用吖啶橙和丹酰戊二胺染色法檢測細(xì)胞自噬水平。(7) Annexin V-FITC/PI和Annexin V-PE/7-AAD染色后用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率(8)建立人源性裸小鼠移植瘤模型檢測體內(nèi)抗腫瘤效果。
　　結(jié)果：⑴用20μM濃度DHA處理HeLa和HCT116后，發(fā)現(xiàn)12h內(nèi)p8、ATF4、CHOP蛋白表達(dá)先后上調(diào)，并且p8、ATF4、CHOP的mRNA均顯著

4、上升。用siRNA沉默p8后發(fā)現(xiàn)ATF4和CHOP的上調(diào)均被抑制，而過表達(dá)p8后ATF4和CHOP的表達(dá)進(jìn)一步上調(diào)，提示DHA誘導(dǎo)的ATF4和CHOP上調(diào)受p8介導(dǎo)調(diào)控。⑵用SRB法檢測DHA對腫瘤細(xì)胞抑制率發(fā)現(xiàn)，p8沉默后的腫瘤細(xì)胞對DHA的敏感性增加，而過表達(dá)p8后腫瘤細(xì)胞對DHA的敏感性降低。在用Western Blot法檢測凋亡蛋白和用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)p8沉默后DHA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡率明顯上升(p＜0.05)

5、，而過表達(dá)p8后細(xì)胞凋亡率下降(p＜0.01)。并且干擾ATF4或CHOP蛋白表達(dá)后同樣也提高了DHA誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡率。⑶用AO和MDC染色法觀察到DHA作用后細(xì)胞內(nèi)自噬泡數(shù)量增加，而干擾p8后細(xì)胞的自噬泡數(shù)量減少，并且用自噬標(biāo)志性蛋白LC3檢測發(fā)現(xiàn)干擾p8后DHA誘導(dǎo)的LC3-Ⅱ的累積水平較對照組明顯下降，而過表達(dá)p8后LC3-Ⅱ的累積水平進(jìn)一步上調(diào)。干擾ATF4和CHOP后同樣也觀察到DHA誘導(dǎo)的細(xì)胞自噬水平下降，提示DHA作用腫瘤

6、細(xì)胞后通過p8-ATF4-CHOP通路誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。⑷將腫瘤細(xì)胞分別預(yù)處理3-MA和氯喹抑制細(xì)胞自噬，或者沉默自噬基因Atg5后，發(fā)現(xiàn)自噬抑制后DHA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡水平明顯升高。提示p8可能通過上調(diào)ATF4和CHOP，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞自噬而降低腫瘤細(xì)胞對DHA的敏感性。⑸將DHA和氯喹(CQ)合用處理腫瘤細(xì)胞，計(jì)算得出協(xié)同指數(shù)表明兩種藥物在體外發(fā)揮協(xié)同抑制腫瘤細(xì)胞增殖作用。在采用HeLa細(xì)胞裸小鼠移植瘤模型評價(jià)DHA與CQ合用對移植瘤

7、的體內(nèi)抑制作用的實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組腫瘤的抑制效果高于單用組，并具有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論：發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞中應(yīng)激相關(guān)蛋白p8的表達(dá)在二氫青蒿素作用后迅速顯著上調(diào)，并介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白ATF4和CHOP表達(dá)的上調(diào)，進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，從而降低二氫青蒿素誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡水平。此外，我們發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素與自噬抑制劑氯喹合用在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中均顯示良好的協(xié)同抗腫瘤效果。這些結(jié)果顯示p8有潛力成為抗腫瘤的新靶點(diǎn)，并為腫瘤治