p8蛋白在二氫青蒿素誘導腫瘤細胞凋亡中的作用研究.pdf

1、目的：二氫青蒿素(DHA)是青蒿素類藥物的主要活性代謝產(chǎn)物，是臨床上應用多年、安全有效的抗瘧藥物。近年來很多研究表明DHA在多種腫瘤模型中表現(xiàn)出良好的抑制腫瘤作用，但是臨床試驗表明單獨使用二氫青蒿素不能達到理想的治療腫瘤效果。應激相關蛋白p8自發(fā)現(xiàn)以來多次被證明與腫瘤發(fā)生和耐藥相關，并且前期研究我們發(fā)現(xiàn)DHA作用后p8的上調(diào)降低了腫瘤細胞對DHA的敏感性。因此本文針對p8上調(diào)引起腫瘤細胞對DHA耐藥的機制進行探究，為提高DHA抗腫瘤治療

2、提供新思路。
　　方法：選用人宮頸癌HeLa細胞，結(jié)腸癌HCT116細胞，探討p8上調(diào)引起腫瘤細胞對DHA耐藥的分子機制。(1)運用Western Blot檢測p8、 ATF4、 CHOP、 caspase3、PARP、LC3等蛋白表達水平(2)運用RT-PCR檢測p8、ATF4、CHOP的mRNA水平。(3)運用磺基羅丹明B(SRB)染色法檢測藥物對細胞的抑制率。(4)運用siRNA技術沉默細胞內(nèi)p8、 ATF4、 CHOP和A

3、tg5的表達。(5)運用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術將細胞內(nèi)p8過表達。(6)使用吖啶橙和丹酰戊二胺染色法檢測細胞自噬水平。(7) Annexin V-FITC/PI和Annexin V-PE/7-AAD染色后用流式細胞術檢測細胞凋亡率(8)建立人源性裸小鼠移植瘤模型檢測體內(nèi)抗腫瘤效果。
　　結(jié)果：⑴用20μM濃度DHA處理HeLa和HCT116后，發(fā)現(xiàn)12h內(nèi)p8、ATF4、CHOP蛋白表達先后上調(diào)，并且p8、ATF4、CHOP的mRNA均顯著

4、上升。用siRNA沉默p8后發(fā)現(xiàn)ATF4和CHOP的上調(diào)均被抑制，而過表達p8后ATF4和CHOP的表達進一步上調(diào)，提示DHA誘導的ATF4和CHOP上調(diào)受p8介導調(diào)控。⑵用SRB法檢測DHA對腫瘤細胞抑制率發(fā)現(xiàn)，p8沉默后的腫瘤細胞對DHA的敏感性增加，而過表達p8后腫瘤細胞對DHA的敏感性降低。在用Western Blot法檢測凋亡蛋白和用流式細胞術檢測細胞凋亡率實驗中，發(fā)現(xiàn)p8沉默后DHA誘導腫瘤細胞凋亡率明顯上升(p＜0.05)

5、，而過表達p8后細胞凋亡率下降(p＜0.01)。并且干擾ATF4或CHOP蛋白表達后同樣也提高了DHA誘導的細胞凋亡率。⑶用AO和MDC染色法觀察到DHA作用后細胞內(nèi)自噬泡數(shù)量增加，而干擾p8后細胞的自噬泡數(shù)量減少，并且用自噬標志性蛋白LC3檢測發(fā)現(xiàn)干擾p8后DHA誘導的LC3-Ⅱ的累積水平較對照組明顯下降，而過表達p8后LC3-Ⅱ的累積水平進一步上調(diào)。干擾ATF4和CHOP后同樣也觀察到DHA誘導的細胞自噬水平下降，提示DHA作用腫瘤

6、細胞后通過p8-ATF4-CHOP通路誘導細胞自噬。⑷將腫瘤細胞分別預處理3-MA和氯喹抑制細胞自噬，或者沉默自噬基因Atg5后，發(fā)現(xiàn)自噬抑制后DHA誘導腫瘤細胞的凋亡水平明顯升高。提示p8可能通過上調(diào)ATF4和CHOP，進一步誘導細胞自噬而降低腫瘤細胞對DHA的敏感性。⑸將DHA和氯喹(CQ)合用處理腫瘤細胞，計算得出協(xié)同指數(shù)表明兩種藥物在體外發(fā)揮協(xié)同抑制腫瘤細胞增殖作用。在采用HeLa細胞裸小鼠移植瘤模型評價DHA與CQ合用對移植瘤

7、的體內(nèi)抑制作用的實驗中，我們發(fā)現(xiàn)聯(lián)合用藥組腫瘤的抑制效果高于單用組，并具有顯著性差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論：發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞中應激相關蛋白p8的表達在二氫青蒿素作用后迅速顯著上調(diào)，并介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白ATF4和CHOP表達的上調(diào)，進一步誘導細胞自噬，從而降低二氫青蒿素誘導腫瘤細胞凋亡水平。此外，我們發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素與自噬抑制劑氯喹合用在體內(nèi)外實驗中均顯示良好的協(xié)同抗腫瘤效果。這些結(jié)果顯示p8有潛力成為抗腫瘤的新靶點，并為腫瘤治