雙氫青蒿素對肺動脈高壓干預作用的實驗研究.pdf

1、背景：
　　肺動脈高壓（pulmonary arterial hypertension，PAH）是一種臨床進展性疾病，主要表現(xiàn)為肺動脈阻力進行增高進而導致右心衰，死亡率高;病理特征為內(nèi)皮細胞及血管平滑肌細胞增殖，中膜肥厚，原位血栓形成。目前治療PAH的藥物主要包括鈣離子拮抗劑、前列環(huán)素類藥物、內(nèi)皮素受體阻滯劑、磷酸二酯酶抑制劑-5等，這些藥物主要通過神經(jīng)內(nèi)分泌機制阻斷肺動脈收縮、擴張肺動脈發(fā)揮其治療作用，雖然對早期患者可改善其癥狀

2、，但不能逆轉(zhuǎn)其病程，療效有限，且價格昂貴。因此尋找療效確切，價格低廉，適合我國國情的藥物有極其重要的意義。青蒿素(artemisinine，Art)屬倍半萜內(nèi)酯化合物，是一種高效低毒的抗瘧藥物，其衍生物主要有雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）、青蒿琥酯(artesunate)、蒿甲醚(artemether)和蒿乙醚（arteether）等，臨床上主要用于治療瘧疾。新近研究表明，除抗瘧作用外，青蒿素還具有抗炎、抗腫

3、瘤、放射增敏、抗菌增敏、抗組織纖維化等作用。青蒿素能否通過抗纖維化或其他機制，抑制肺動脈高壓過程中的肺動脈重構(gòu)，進而對肺動脈高壓產(chǎn)生保護作用。目前，這方面的研究鮮見文獻報道。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素在體內(nèi)的主要代謝物，與青蒿素比較，DHA具有水溶性更好，生物利用度更高，抗瘧效力更強的特點。本實驗擬通過野百合堿建立大鼠肺動脈高壓模型，應用DHA對大鼠肺動脈高壓進行干預，探討DHA對肺高壓大鼠血流動

4、力學及肺血管重構(gòu)的影響;探討DHA對MCT誘導的肺動脈高壓大鼠右室心肌細胞超微結(jié)構(gòu)及右室心肌細胞凋亡的影響;探討DHA對野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠VEGF、ICAM-1、表達的影響。研究DHA對肺動脈高壓大鼠是否具有保護作用及其作用機制。
　　目的：
　　觀察雙氫青蒿素對野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠肺動脈壓力的作用，探討雙氫青蒿素對野百合堿肺動脈高壓大鼠模型的肺動脈重構(gòu)的影響及相關機制。
　　方法：
　　1雙氫青蒿

5、素對肺高壓大鼠血流動力學及肺血管重構(gòu)的影響
　　將30只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、肺動脈高壓模型組和雙氫青蒿素干預組，每組10只。肺動脈高壓模型組和雙氫青蒿素干預組給予野百合堿60mg/kg皮下注射，建立大鼠肺動脈高壓模型，正常對照組給予等劑量的生理鹽水（60mg/kg，約6ml/kg）皮下注射。3周后，干預組每天給予雙氫青蒿素（溶于植物油中）60mg/kg/d灌胃，其余兩組給予等劑量的淀粉溶液灌胃，持續(xù)3周后進行血流動力學

6、檢測及形態(tài)學觀察;以導管法觀察其平均肺動脈壓（mPAP）、組織病理學檢查觀察新生內(nèi)膜形成、計算右心室肥大指數(shù)即右心室/左心室+室間隔（RV/LV+S）的變化;評價肺動脈管壁厚度和管腔面積;免疫組化染色計算肺小動脈無肌性血管肌化程度、肺動脈平滑肌細胞的增殖度、VG染色評價新生內(nèi)膜細胞的增殖度;天狼猩紅染色評價心肌膠原沉積。
　　2雙氫青蒿素對野百合堿誘導的肺動脈高壓大鼠右室心肌細胞超微結(jié)構(gòu)及右室心肌細胞凋亡的影響
　　將30只

7、雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、肺動脈高壓模型組和雙氫青蒿素干預組，每組10只，動物模型的制備及分組同第一部分。游離右心室，取右室游離壁中部1mm3心肌標本2～3塊，立即行2.5％戊二醛-1％鋨酸雙固定;常規(guī)乙醇、丙酮逐級脫水;環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機切片，醋酸雙氧鈾及枸櫞酸鉛雙重染色，以H-500透射電鏡觀察并拍照以觀察MCT誘導的大鼠右室心肌細胞的超微結(jié)構(gòu)的改變。
　　采用TUNEL法檢測，參照In situ Cell Dea

8、th Dection，POD Kit說明操作。常規(guī)石蠟切片，脫蠟至水;3％甲醇過氧化氫阻斷POD;蛋白酶K37℃孵育，加入TUNEL液(1∶9); POD轉(zhuǎn)換液;DAB顯色，蘇木素復染;晾干，封片，鏡檢。光學顯微鏡觀察并計算右室心肌細胞凋亡指數(shù)。
　　3.雙氫青蒿素對野百合堿誘導肺動脈高壓大鼠VEGF、ICAM-1表達的影響
　　將30只雄性SD大鼠隨機分為正常對照組、肺動脈高壓模型組和雙氫青蒿素干預組，每組10只，動物模型

9、的制備及分組同第一部分。采用放射免疫分析法測定血液中VEGF、ICAM-1等因子的含量;應用RT-PCR及Western blot技術(shù)檢測肺動脈中VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達。
　　結(jié)果：
　　1、野百合堿皮下注射可引起大鼠嚴重肺高壓形成，并出現(xiàn)新生內(nèi)膜，肺動脈高壓組mPAP、右心室重量、腺泡內(nèi)肺小動脈肌化程度、肺小動脈中膜厚度百分比、肺小動脈新生內(nèi)膜增殖度較其它各組顯著升高(P＜0.01)。經(jīng)雙氫青蒿素干

10、預后，mPAP有所下降、右室肥大指數(shù)、肺小動脈肌化程度、肺小動脈中膜厚度及新生內(nèi)膜增殖度均有所減輕(P＜0.05)。
　　2、各實驗組右室心肌細胞超微結(jié)構(gòu)所見:正常對照組肌絲排列整齊，肌小節(jié)Z線、M線清晰可見，心肌細胞核膜清晰，核結(jié)構(gòu)完整，線粒體飽滿，嵴完整。模型組肌絲大量斷裂、溶解，線粒體腫脹，部分嵴斷裂并伴有明顯空泡樣變性;心肌細胞胞質(zhì)濃縮、染色質(zhì)邊集濃聚;雙氫青蒿素干預組心肌超微結(jié)構(gòu)損傷較模型組為輕，肌絲排列尚整齊，肌節(jié)結(jié)構(gòu)

11、基本清晰，線粒體輕度腫脹。經(jīng)TUNEL法檢測，青蒿素干預組，心肌細胞凋亡程度較模型組有所減輕(P＜0.05)。
　　3、各組大鼠血清中均可測到不同濃度的VEGF、ICAM-1，與模型組相比，雙氫青蒿素干預組內(nèi)VEGF、ICAM-1的濃度明顯低于模型組(P＜0.05)。
　　各組肺動脈內(nèi)均可見VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達。與對照組相比，模型組內(nèi)VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達明顯高于對照組(P＜

12、0.01)，差異有顯著統(tǒng)計學意義。干預組內(nèi)VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達高于對照組(P＜0.01)，差異有統(tǒng)計學意義。與肺動脈高壓組相比，干預組內(nèi)VEGF、ICAM-1 mRNA及蛋白質(zhì)的表達明顯低于肺動脈高壓組(P＜0.05)，差異有顯著統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)論：
　　1、雙氫青蒿素可直接降低MCT誘導的肺動脈高壓模型大鼠的肺動脈壓、明顯抑制其肺血管構(gòu)型重建、減輕右心室肥厚。
　　2、雙氫青蒿素可抑制或