Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠干預(yù)作用的研究.pdf

1、低氧性肺動(dòng)脈高壓(hypoxicpulmonaryhypertension,HPH)是一些心肺血管疾病最常見的并發(fā)癥，以肺動(dòng)脈壓力增高、肺血管結(jié)構(gòu)重建和右心室肥厚為特征，如不干預(yù)，病情日益加重，可導(dǎo)致右心衰竭而死亡。目前其發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚，臨床上也缺乏理想的治療藥物。因此，對(duì)HPH形成機(jī)制的研究及其研發(fā)有效的防治HPH的藥物顯得尤為必要。HPH是一個(gè)由多種分子和多種靶細(xì)胞相互作用的復(fù)雜過(guò)程，而其中何種因素在HPH的發(fā)生與發(fā)展階段起關(guān)

2、鍵作用，尚無(wú)明確的結(jié)論。近年來(lái)，Rho/Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與心肺血管疾病之間的關(guān)系受到了日益廣泛的關(guān)注。有研究表明，選擇性阻斷該信號(hào)通路可以改善心肺血管損傷的進(jìn)展和預(yù)后，然而其確切的作用機(jī)制尚不清楚。 本研究觀察Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺血管結(jié)構(gòu)變化的影響，并應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)以及蛋白免疫印跡技術(shù)，從基因和蛋白質(zhì)水平研究Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)Rho/Rho激酶信號(hào)通路的作用及其機(jī)制，并研究該信號(hào)

3、通路與HPH形成與發(fā)展的相關(guān)性，為研發(fā)新一代治療藥物提供有益的靶標(biāo)，也為臨床治療HPH提供實(shí)驗(yàn)及理論依據(jù)。 第一部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠的作用——血流動(dòng)力學(xué)與病理學(xué)研究 目的：建立低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)大鼠模型，探討HPH形成的病理機(jī)制，研究Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)大鼠形成HPH過(guò)程中肺動(dòng)脈壓增高及肺血管結(jié)構(gòu)重建的影響。 方法：72只雄性SD大鼠，隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、低氧模型組和

4、法舒地爾干預(yù)組。采用常壓間斷低氧法[(10±0.5)﹪O2，每天間斷低氧8小時(shí)，每周6天，共21天]建立大鼠HPH模型。分別于低氧不同階段(第3天、7天、14天和21天)測(cè)定各組大鼠平均肺動(dòng)脈壓力(meanpulmonaryarterypressure,mPAP)、平均頸動(dòng)脈壓力(meancervicalarterialpressure,mCAP)、右心室肥厚指數(shù)(rightventricularhypertrophyindex，RVH

5、I)；光鏡下結(jié)合圖像分析進(jìn)行肺血管結(jié)構(gòu)重建觀察；透射電鏡觀察肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化。 結(jié)果：(1)低氧7天起模型組大鼠mPAP、肺小動(dòng)脈管壁厚度/外徑(WT﹪)、管壁面積/管總面積(WA﹪)、管腔面積/管總面積(LA﹪)、肌型動(dòng)脈占位比、非肌型動(dòng)脈占位比、中膜細(xì)胞核數(shù)密度分別為(19.50±0.95)mmHg、(19.75±3.41)﹪、(36.92±4.19)﹪、(60.38±4.19)﹪、(24.83±2.48)﹪、

6、(59.34±6.12)﹪、(8.17±1.17)與對(duì)照組(15.75±1.16)mmHg、(12.96±2.21)﹪、(31.42±3.61)﹪、(68.58±3.61)﹪、(8.50±1.38)﹪、(76.00±4.34)﹪、(5.83±0.75)比較差異有顯著性(P均＜0.05)，并隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)日趨明顯；低氧14天RVHI為(35.56±2.39)﹪與對(duì)照組(24.60±2.14)﹪比較明顯升高(P＜0.01)。(2)法舒地爾干

7、預(yù)組大鼠在低氧7天后mPAP、WT﹪、WA﹪、LA﹪、肌型動(dòng)脈占位比、非肌型動(dòng)脈占位比、肺血管中膜細(xì)胞核數(shù)密度分別為(16.00±0.91)mmHg、(15.32±2.20)﹪、(34.20±4.87)﹪、(65.80±4.87)﹪、(9.66±1.21)﹪、(74.67±3.93)﹪、(6.50±1.52)與模型組(19.50±0.95)mmHg、(19.75±3.41)﹪、(36.92±4.19)﹪、(60.38±4.19)﹪、(2

8、4.83±2.48)﹪、(59.34±6.12)﹪、(8.17±1.17)比較差異均有顯著性(P均＜0.05)；法舒地爾干預(yù)組低氧14天RVHI為(26.61±1.26)﹪與模型組(35.56±2.39)﹪比較顯著降低(P＜0.01)。(3)各組間mCAP無(wú)顯著性差異(P均＞0.05)。(4)透射電鏡結(jié)果顯示模型組大鼠低氧早期肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)即受到明顯損傷，以線粒體損傷改變最為明顯，且隨低氧時(shí)間延長(zhǎng)而加重，后期內(nèi)皮細(xì)胞周圍平滑肌細(xì)胞

9、增生、腫脹，膠原纖維增生；法舒地爾干預(yù)組肺小動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞損傷、平滑肌細(xì)胞及膠原纖維增生均明顯減輕。 結(jié)論：Rho激酶抑制劑法舒地爾能夠預(yù)防常壓低氧狀態(tài)導(dǎo)致的肺動(dòng)脈高壓的形成與發(fā)展，其機(jī)制在于降低肺動(dòng)脈高壓和抑制肺血管結(jié)構(gòu)重建。 第二部分Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織Rho/Rho激酶表達(dá)及干預(yù)影響 目的：探討Rho激酶抑制劑法舒地爾對(duì)低氧性肺動(dòng)脈高壓(HPH)大鼠不同階段肺組織Rho/Rho

10、激酶的表達(dá)及干預(yù)影響。 方法：72只雄性SD大鼠，隨機(jī)均分為正常對(duì)照組、低氧模型組和法舒地爾干預(yù)組。采用常壓間斷低氧法建立大鼠HPH模型。半定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)測(cè)定各組大鼠肺組織Rho激酶及成肌纖維細(xì)胞標(biāo)志基因α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(smoothmusclealpha-actin,α-SMA)mRNA表達(dá)水平；免疫印跡法(Westernblot)檢測(cè)各組大鼠肺組織Rho激酶蛋白的表達(dá)水平，并檢測(cè)Rho激酶底物——肌

11、球蛋白磷酸酶結(jié)合亞單位第697位蘇氨酸(MBSThr-697)的磷酸化水平，作為Rho/Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活化指標(biāo)。將上述指標(biāo)與肺動(dòng)脈壓力(mPAP)及右心室肥厚指數(shù)(RVHI)進(jìn)行相關(guān)分析，了解該信號(hào)通路的活性與肺動(dòng)脈高壓進(jìn)展之間的關(guān)系。 結(jié)果：Rho激酶mRNA和蛋白在HPH發(fā)生早期即明顯上調(diào)，至模型后期仍維持于較高水平，肌球蛋白磷酸酶磷酸化水平也較對(duì)照組顯著增高(P均＜0.01)，并與mPAP及RVHI均呈明顯正相關(guān)(

12、P均＜0.01)；Rho激酶mRNA表達(dá)較成肌纖維細(xì)胞標(biāo)志基因α-SMA提前達(dá)到高峰，二者呈顯著正相關(guān)(r=0.883，P＜0.05)；法舒地爾干預(yù)后Rho激酶mRNA和蛋白、肌球蛋白磷酸酶磷酸化水平、α-SMAmRNA均明顯降低。 結(jié)論：(1)HPH大鼠肺組織中存在Rho激酶的表達(dá)上調(diào)與功能活化，提示Rho/Rho激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與HPH的形成過(guò)程，并且可能通過(guò)調(diào)節(jié)成肌纖維細(xì)胞的增生來(lái)發(fā)揮作用。(2)Rho激酶抑制劑法舒地爾