Caveolin-3基因P47L和P104L突變對骨骼肌細胞糖代謝的影響及其機制研究.pdf

1、目的： Caveolin-3(CAV3，微囊蛋白3)蛋白是一種肌細胞特異蛋白，在調(diào)節(jié)胰島素信號通路、葡萄糖代謝以及維持肌肉生理結構和功能發(fā)揮重要作用。2型糖尿?。╰ype2 diabetes mellitus，T2DM）的發(fā)病具有明顯的遺傳背景，我們前期發(fā)現(xiàn)T2DM病人存在CAV3基因的外顯子突變。CAV3基因突變還與多種肌組織病變有關，其中一種人類常染色體顯性遺傳的肢帶型肌營養(yǎng)不良（limb girdle muscular dystr

2、ophy-1C，LGMD-1C)是由于CAV3基因的編碼區(qū)P104L突變導致，肌無力為主要臨床表現(xiàn)。T2DM和LGMD-1C的發(fā)病是否由于CAV3突變導致骨骼肌細胞糖代謝障礙、糖利用下降和供能不足尚未清楚。本實驗旨在從細胞水平研究T2DM的CAV3基因P47L突變和LGMD-1C的CAV3基因P104L突變對骨骼肌細胞胰島素信號通路及其糖代謝的影響，探討T2DM及LGMD-1C的發(fā)病機制。
　　方法：我們利用生物信息學分析LGMD

3、-1C的P104L突變以及T2DM病人CAV3基因編碼區(qū)的3個錯義突變：K14N、D15H和P47L，選P47L和P104L突變點在野生型CAV3的基礎上構建表達載體，用脂質(zhì)體轉染試劑盒Lipofectamine3000轉染入C2C12成肌細胞中。建立4組表達不同基因型的細胞株：轉染對照空載體的陰性對照（NC）組、轉染野生型CAV3基因的野生型（WT）組、轉染P47L突變組和轉染P104L的突變組。用葡萄糖氧化酶-過氧化物酶法（GOD-

4、POD）和糖原測定試劑盒分別檢測100 nM胰島素刺激后4組分化的C2C12細胞的葡萄糖消耗和糖原合成，Western blot檢測胰島素介導的糖代謝相關信號分子的蛋白表達量，免疫共聚焦觀察CAV3和GLUT4的細胞定位和表達。
　　結果：（1）通過生物信息學綜合分析，K14N、D15H和P47L突變使蛋白質(zhì)的二級結構都發(fā)生了改變，并且P47L突變位于Caveolin（CAV）家族的保守序列區(qū)，P104L位于CAV3蛋白的穿膜區(qū)。

5、
　?。?）與WT組相比，P47L和P104L突變組中的C2C12成肌細胞胰島素刺激后葡萄糖的消耗和糖原合成減少（P<0.05）；與NC組比較，過表達野生型CAV3增加葡萄糖的消耗（P<0.05）和糖原合成。
　　（3）Western blot結果顯示，與WT組相比，P47L和P104L突變組中CAV3、CAV1和磷酸化的Akt（pAkt）蛋白表達降低；4組細胞總蛋白GLUT4和Akt表達無明顯差異。免疫共聚焦可以看出，與W

6、T組相比，P47L組細胞膜上CAV3和GLUT4表達減少；與NC組相比，WT組細胞膜上GLUT4表達明顯增多。而P104L突變使CAV3和GLUT4聚集在核旁，胞膜上表達缺失。
　　結論： CAV3基因P47L和P104L突變都導致C2C12細胞葡萄糖攝取和糖原合成減少，其原因可能是突變通過減少膜上CAV3的表達，抑制胰島素信號的Akt通路，導致GLUT4移位到胞膜受阻，從而減少葡萄糖攝取和糖原合成。此外，這兩個突變都導致CAV家