lncRNA BANCR在肝癌中的生物學(xué)作用及對(duì)相關(guān)信號(hào)通路的影響.pdf

1、目的：⑴研究BANCR在肝癌組織及肝癌細(xì)胞中的表達(dá)及意義；⑵觀察BANCR對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響；⑶觀察肝癌細(xì)胞中BANCR與MEK/MAPK信號(hào)通路的相關(guān)性；⑷觀察BANCR對(duì)裸鼠皮下成瘤的影響;研究BANCR對(duì)腫瘤組織中凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、cleaved caspase-3的影響;探討B(tài)ANCR對(duì)腫瘤組織中MEK、P38MAPK信號(hào)通路的影響。
　　方法：①Real-time PCR檢測(cè)肝癌組織及其對(duì)應(yīng)的癌

2、周正常組織中BANCR mRNA表達(dá)，然后檢測(cè)肝癌細(xì)胞株HepG2、Hep3B、Huh7、SMMC7721及正常人肝細(xì)胞株L02中BANCR mRNA表達(dá)，之后應(yīng)用慢病毒載體介導(dǎo)的方法干擾BANCR的表達(dá)，驗(yàn)證干擾效率。②MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)法、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)、AnnexinⅤ/PI染色、Hoechst33342染色、劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell小室實(shí)驗(yàn)（Matrigel基質(zhì)膠）及western blot檢測(cè)干擾BANCR表達(dá)后

3、對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移及侵襲的影響。③Western-blot觀察BANCR對(duì)MEK、MAPK信號(hào)通路的影響。④裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)BANCR對(duì)腫瘤形成的影響。
　　結(jié)果：⑴分別與癌旁正常肝組織和人肝臟細(xì)胞相比，BANCR在肝癌組織和肝癌細(xì)胞上均存在高表達(dá)。⑵MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:在Huh7細(xì)胞和HepG2細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染shRNA-BANCR后24h，48h，72h和96h細(xì)胞增殖率與轉(zhuǎn)染shRNA-NC組細(xì)胞比較明顯降

4、低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。⑶克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:Huh7細(xì)胞:shRNA-BANCR組細(xì)胞克隆形成率為21.78±3.15％，shRNA-NC組細(xì)胞克隆形成率為36.78±4.03％，與NC組相比，shRNA-BANCR組細(xì)胞克隆形成率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。HepG2細(xì)胞，shRNA-BANCR組中細(xì)胞克隆形成率為19.44±2.59％，shRNA-NC組中細(xì)胞克隆形成率為38.56±3.91％，與NC

5、組相比，shRNA-BANCR組細(xì)胞克隆形成率降低，差異有顯著性(p＜0.01)。⑷流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果顯示:Huh7細(xì)胞中，shRNA-BANCR組細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例為73.60±5.11％，NC組中G0/G1期細(xì)胞比例為54.47±5.62％，與NC組比較，shRNA-BANCR組細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)。HepG2細(xì)胞中，shRNA-BANCR組細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例為79.

6、33±3.29％，NC組中G0/G1期細(xì)胞比例為56.23±5.65％，與NC組比較，shRNA-BANCR組細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。⑸AnnexinⅤ/PI染色結(jié)果顯示:在Huh7細(xì)胞，shRNA-BANCR組細(xì)胞凋亡率為23.51±1.95％，NC組細(xì)胞凋亡率為4.53±0.23％，兩組比較，shRNA-BANCR組細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。在HepG2細(xì)胞中，sh

7、RNA-BANCR組凋亡率為22.79±1.70％，NC組細(xì)胞凋亡率為1.61±0.20％，兩組比較，shRNA-BANCR組細(xì)胞凋亡率增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。⑹Hoechst33342染色結(jié)果所示:熒光顯微鏡下觀察:NC組細(xì)胞染色后細(xì)胞核顯示為顏色分布均勻的弱藍(lán)色熒光，shRNA-BANCR組細(xì)胞染色后細(xì)胞核多呈現(xiàn)亮藍(lán)色熒光，可見(jiàn)典型凋亡小體，與NC組比較，shRNA-BANCR組中細(xì)胞核呈弱藍(lán)色熒光的數(shù)量減少，呈亮

8、藍(lán)色熒光的凋亡細(xì)胞核數(shù)量增加。⑺Western-blot結(jié)果顯示:在Huh7細(xì)胞，BANCR表達(dá)下調(diào)顯著增加促凋亡蛋白Bax(P＜0.001)、Cleaved caspase-3(P＜0.001)的蛋白表達(dá)，降低抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)(P＜0.001)，提高Bax/Bcl-2之間的比例。在HepG2細(xì)胞中，BANCR表達(dá)下調(diào)顯著增加促凋亡蛋白Bax(P＜0.01)、Cleaved caspase-3(P＜0.001)的蛋白表達(dá)，

9、降低抑制凋亡蛋白Bcl-2蛋白表達(dá)(P＜0.001)，提高Bax/Bcl-2之間的比例。⑻劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果顯示:Huh7細(xì)胞:shRNA-BANCR組細(xì)胞12h的遷移率為10.64±1.62％，NC組細(xì)胞12h的遷移率為20.77±3.15％，與NC組相比，shRNA-BANCR組細(xì)胞遷移率降低，差異有顯著性(P＜0.01);shRNA-BANCR組細(xì)胞24h的遷移率為28.97±3.24％，NC組細(xì)胞24h的遷移率為46.42±5.8

10、5％，與NC組相比，shRNA-BANCR組細(xì)胞遷移率降低，差異有顯著性(P＜0.01)。HepG2細(xì)胞:shRNA-BANCR組細(xì)胞12h的遷移率為18.85±2.16％，NC組細(xì)胞12h的遷移率為36.33±4.50％，與NC組相比，shRNA-BANCR組細(xì)胞遷移率降低，差異有顯著性(P＜0.01);shRNA-BANCR組細(xì)胞24h的遷移率為31.95±5.11％，NC組細(xì)胞24h的遷移率為64.30±7.29％，與NC組相比，

11、shRNA-BANCR組細(xì)胞遷移率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。⑼Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示:觀察穿過(guò)微孔膜細(xì)胞的數(shù)目:Huh7細(xì)胞中:shRNA-BANCR組細(xì)胞為36.40±4.22個(gè)，NC組細(xì)胞為62.00±6.89個(gè)，與NC組相比，shRNA-BANCR組細(xì)胞穿過(guò)微孔膜細(xì)胞的數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。HepG2細(xì)胞:shRNA-BANCR組細(xì)胞為50.00±5.70個(gè)，NC組細(xì)胞為66.40±6.

12、19個(gè)，兩組比較，shRNA-BANCR組細(xì)胞穿過(guò)微孔膜細(xì)胞的數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。⑽Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示:Huh7細(xì)胞:E-cadherin蛋白含量:與NC組比較，shRNA-BANCR組表達(dá)增加，有顯著性差異(P＜0.001); vimentin蛋白含量:與NC組比較，shRNA-BANCR組下降，有顯著性差異(P＜0.001)。HepG2細(xì)胞:E-cadherin蛋白含量:與NC組比較，shR

13、NA-BANCR組表達(dá)增加，有顯著性差異(P＜0.001);vimentin蛋白含量:與NC組比較，shRNA-BANCR組表達(dá)下降，有顯著性差異(P＜0.001)。⑾Western blot結(jié)果顯示:在Huh7肝癌細(xì)胞中，與NC組比較，shRNA-BANCR組中p-MEK(P＜0.001)、p-ERK(P＜0.001)、p-JNK(P＜0.001)蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-P38蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。在He

14、pG2肝癌細(xì)胞中，與NC組比較，shRNA-BANCR組中p-MEK(P＜0.05)、p-ERK(P＜0.001)、p-JNK(P＜0.001)蛋白表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，p-P38蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。⑿裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:shRNA-BANCR組腫瘤體積及重量與NC組比較減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Western blot結(jié)果顯示:與NC組比較，下調(diào)BANCR后裸鼠腫瘤組織中Bcl-2蛋白的表

15、達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，cleaved caspase-3蛋白表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)，p-MEK蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.001)，p-P38蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)。
　　結(jié)論：①BANCR在肝癌組織、Huh7和HepG2肝癌細(xì)胞中均呈現(xiàn)高表達(dá)。②下調(diào)BANCR抑制肝癌細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲，促進(jìn)其凋亡。③下調(diào)BANCR抑制肝癌細(xì)胞中MEK/ERK/JNK信號(hào)通路