慢性應(yīng)激對SAMP8小鼠認知功能的影響及氟西汀的改善作用.pdf

1、應(yīng)激是機體對內(nèi)部或外界各種刺激所產(chǎn)生的一種非特異性應(yīng)答反應(yīng)的總和。適度應(yīng)激能夠促使人體進行合理的自我心理和生理狀態(tài)的調(diào)整，有助于提高機體的適應(yīng)能力和活動效率。然而過強的應(yīng)激或者長期慢性應(yīng)激狀態(tài)，均會累及我們的心身健康和生活質(zhì)量。面對同樣或相類似的應(yīng)激因素，不同的個體表現(xiàn)出的適應(yīng)能力是不同的，這與身體素質(zhì)、健康狀況、個人經(jīng)歷以及對待事物的不同評價等相關(guān)，即為應(yīng)激反應(yīng)的個體差異性及主觀性。已經(jīng)證實，老化個體更容易患有神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，同時

2、，機體內(nèi)環(huán)境的變化可以波及大腦對應(yīng)激的反應(yīng)。那么，腦老化伴隨的一系列腦組織結(jié)構(gòu)和功能變化是否會促使機體對應(yīng)激的反應(yīng)更加強烈？應(yīng)激造成的認知功能下降是否受到腦老化的影響，其機制有哪些？雖然大量研究探索了應(yīng)激反應(yīng)對腦功能的影響，但慢性應(yīng)激與老化和認知功能的關(guān)系及相關(guān)機制仍需要進一步探究。
　　不可預(yù)知性慢性溫和應(yīng)激（UCMS）是研究應(yīng)激相關(guān)機制較為理想的模型，采用多種不同的心理和/或環(huán)境應(yīng)激源，模擬與人類環(huán)境相似的應(yīng)激狀況，是目前比較

3、常用和公認的模型。連續(xù)數(shù)周的慢性應(yīng)激可使動物表現(xiàn)出應(yīng)激相關(guān)的各種病理性表現(xiàn)，包括情緒、神經(jīng)內(nèi)分泌、神經(jīng)化學(xué)以及行為學(xué)等方面的變化。SAMP8小鼠表現(xiàn)為較早出現(xiàn)的認知下降（快速老化），并出現(xiàn)與阿爾茨海默病類似的神經(jīng)病理改變，是研究老化較為理想的模型。SAMR1小鼠無快速老化的相關(guān)特征，通常作為SAMP8的對照組。Morris水迷宮測試和新異物體識別實驗是較為經(jīng)典的測定嚙齒類動物認知功能的實驗方法，分別用于評價與海馬相關(guān)的空間及情景記憶等方

4、面的認知功能變化。
　　突觸可塑性在出生后隨著發(fā)育逐漸變化，成年時相對穩(wěn)定，老年階段緩慢退化。海馬的突觸可塑性在學(xué)習(xí)和記憶的形成、神經(jīng)變性性疾病的發(fā)展過程中起到了重要的作用。海馬區(qū)突觸結(jié)構(gòu)和功能的變化可導(dǎo)致認知功能的改變。因此，海馬突觸可塑性可視為腦老化相關(guān)認知功能障礙的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　氟西汀是一種選擇性的5-羥色胺再攝取抑制劑，主要用于抑郁癥的治療。已有研究報道，氟西汀可以對抗神經(jīng)元毒性，有效促進神經(jīng)元的分化，提高突

5、觸可塑性，具有神經(jīng)保護作用，改善認知功能障礙。本課題組前期亦有研究結(jié)果顯示，氟西汀對于應(yīng)激后成年SD大鼠的認知功能及抑郁情緒具有改善作用，而氟西汀對于應(yīng)激后老齡SAMP8小鼠認知功能的影響還未有報道。
　　本課題采用SAMP8小鼠和SAMR1小鼠作為研究對象，觀察不可預(yù)知性慢性溫和應(yīng)激對快速老化小鼠和老化抵抗小鼠的神經(jīng)病理學(xué)、學(xué)習(xí)記憶能力、突觸結(jié)構(gòu)可塑性的影響，并進一步探討SSRI藥物氟西汀對于應(yīng)激后相關(guān)認知功能障礙的治療作用，并

6、探討相關(guān)機制。
　　第一部分：慢性應(yīng)激對SAMP8小鼠認知功能和神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的影響
　　目的：
　　觀察不可預(yù)知性慢性溫和應(yīng)激對SAMR1和SAMP8小鼠的神經(jīng)病理學(xué)和學(xué)習(xí)記憶能力的影響，明確快速老化小鼠和老化抵抗小鼠的大腦對應(yīng)激的耐受力是否存在差異。
　　方法：
　　1.采用6月齡雄性SAMR1及SAMP8小鼠，隨機分為四組:
　　1）R1（SAMR1小鼠不接受應(yīng)激處理）；
　　2）UCMS+

7、R1（SAMR1小鼠接受應(yīng)激處理）；
　　3）P8（SAMP8小鼠不接受應(yīng)激處理）；4）UCMS+P8（SAMP8小鼠接受應(yīng)激處理）。UCMS處理連續(xù)4周，建立慢性應(yīng)激模型。
　　2.記錄在應(yīng)激操作開始前和4周的應(yīng)激操作結(jié)束后行為學(xué)開始前的體重，分別記錄為應(yīng)激前和應(yīng)激后的體重，反應(yīng)小鼠的整體狀態(tài)。
　　3.完成4周的慢性應(yīng)激后，采用新異物體識別實驗和Morris水迷宮實驗觀察各組小鼠的認知功能。
　　4.行為學(xué)實

8、驗后通過透射電子顯微鏡觀察各組小鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及突觸的超微結(jié)構(gòu)。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)激操作開始前，兩組 SAMR1小鼠之間的體重?zé)o明顯差異（P>0.05），兩組SAMP8小鼠之間的體重?zé)o明顯差異（P>0.05）。應(yīng)激結(jié)束后， SAMR1小鼠與 SAMR1應(yīng)激組小鼠之間體重?zé)o明顯差異（P>0.05）；與SAMP8組的小鼠相比，UCMS+P8組小鼠體重明顯下降（P<0.05）。以上結(jié)果表明，慢性應(yīng)激對SAMR1小鼠的體

9、重?zé)o明顯影響，慢性應(yīng)激后SAMP8小鼠的體重下降。
　　2.新異物體識別實驗結(jié)果顯示，在1小時和24小時的時間測試各組小鼠對兩個物體的總觸碰時間沒有明顯的差異（P>0.05）。在1小時和24小時測試結(jié)果顯示，SAMR1小鼠與SAMR1應(yīng)激組小鼠的認知指數(shù)相比無明顯差異（P>0.05）；SAMP8組的小鼠的認知指數(shù)與SAMR1小鼠相比降低（P<0.05），同時，與SAMP8組的小鼠相比，UCMS+P8組小鼠的認知指數(shù)明顯下降（P<0

10、.05）。
　　3.MWM水迷宮實驗評價了各組小鼠海馬依賴性的空間學(xué)習(xí)記憶能力。定位巡航實驗結(jié)果顯示，R1組和UCMS+R1組小鼠的逃避潛伏期無顯著的差異（P>0.05）。與R1組小鼠相比， P8組小鼠的逃避潛伏期明顯延長（P<0.05）。然而，慢性應(yīng)激進一步增加了延長的逃避潛伏期(P<0.05， UCMS+P8 vs P8組)。在空間探索實驗中，我們撤去水下隱形平臺。R1組和UCMS+R1組小鼠的穿越平臺次數(shù)無顯著差異（P>0.

11、05）。與R1組小鼠相比，P8組小鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。UCMS+P8組小鼠的穿越平臺次數(shù)進一步減少(P<0.05， UCMS+P8 vs P8組)。上述結(jié)果說明SAMP8小鼠的老化因素導(dǎo)致了其的認知功能下降，而慢性應(yīng)激進一步加劇了SAMP8小鼠的認知功能障礙，而本實驗采用的應(yīng)激方案對 SAMR1小鼠的認知功能無明顯影響。
　　4.透射電子顯微鏡觀察了各組小鼠之間海馬CA1區(qū)神經(jīng)元和突觸超微

12、結(jié)構(gòu)的差異。SAMR1組小鼠海馬神經(jīng)元細胞膜清晰可見，細胞質(zhì)基質(zhì)及核糖體分布均勻，線粒體膜及線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰完整，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈現(xiàn)片層狀或管泡狀，高爾基復(fù)合體由單層膜構(gòu)成4-8個平行排列的扁囊，中間形成囊腔，細胞核核質(zhì)分布均勻；突觸數(shù)量較多，突觸前膜、后膜及間隙結(jié)構(gòu)清晰，突觸之間的鏈接部位明顯，突觸小泡數(shù)量豐富。UCMS+R1組小鼠海馬神經(jīng)元較SAMR1組無明顯改變，細胞基質(zhì)內(nèi)偶爾可見脂肪滴及脂褐素；UCMS+R1組小鼠與SAMR1組比較

13、，突觸結(jié)構(gòu)無明顯改變。SAMP8組小鼠海馬神經(jīng)元細胞膜尚完整，細胞質(zhì)基質(zhì)及核糖體分布尚均勻，線粒體嵴膜部分融合，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，部分高爾基復(fù)合體膜結(jié)構(gòu)模糊，細胞核和核膜結(jié)構(gòu)尚完整，細胞質(zhì)和胞核出現(xiàn)水腫；突觸結(jié)構(gòu)欠清晰，偶爾可見突觸前末端腫脹。UCMS+P8組小鼠海馬神經(jīng)元細胞膜模糊不清，細胞質(zhì)出現(xiàn)水腫，基質(zhì)不均勻，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基復(fù)合體等各種細胞器數(shù)量均減少，線粒體嵴膜融合嚴重，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒。胞核內(nèi)染色質(zhì)邊集、核膜模糊。突

14、觸前膜腫脹并破壞，突觸后膜增厚，突觸間隙模糊。
　　第二部分：慢性應(yīng)激對SAMP8小鼠突觸可塑性相關(guān)標志物的影響
　　目的：
　　觀察SAMR1及SAMP8小鼠海馬部位突觸可塑性相關(guān)標志物的蛋白和mRNA水平的表達，從而探討慢性應(yīng)激后相關(guān)的分子生物學(xué)機制，明確SAMP8小鼠應(yīng)激耐受力下降的原因。
　　方法：
　　1.動物分組及模型制備同第一部分。
　　2.蛋白印跡（Western blotting）實

15、驗方法觀察各組小鼠海馬PSD95、SYN、BDNF和TrkB蛋白水平的表達。
　　3.RT-PCR實驗方法觀察各組小鼠海馬PSD95、SYN、BDNF和TrkB mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　1.慢性應(yīng)激對小鼠海馬PSD95和SYN蛋白和mRNA水平的影響。與SAMR1小鼠相比， SAMP8小鼠海馬PSD95和SYN蛋白的表達降低（P<0.05）。R1組和UCMS+R1組小鼠海馬PSD95和SYN蛋白的表達無顯著差

16、異，應(yīng)激對SAMR1小鼠海馬突觸可塑性相關(guān)蛋白的表達無明顯影響（P>0.05）。與P8組相比，UCMS+P8組小鼠海馬PSD95和SYN蛋白表達水平進一步降低（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果與Western blotting類似。PSD95和SYN mRNA在SAMR1組海馬的表達明顯高于SAMP8小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與P8組小鼠相比，UCMS+P8組小鼠海馬PSD95和SYN mRNA的表達明顯下降（P<0.05

17、），而R1組和UCMS+R1組之間海馬mRNA的表達無明顯差異。結(jié)果顯示UCMS后SAMP8小鼠海馬PSD95和SYN mRNA及蛋白的表達下降。
　　2.慢性應(yīng)激對小鼠海馬BDNF和TrkB蛋白的影響。與SAMR1小鼠相比，SAMP8小鼠海馬BDNF和TrkB蛋白的表達降低（P<0.05）。R1組和UCMS+R1組小鼠海馬BDNF和TrkB蛋白的表達沒有顯著的差異，應(yīng)激對SAMR1小鼠海馬BDNF和TrkB蛋白的表達無明顯影響（

18、P>0.05）。與P8組相比， UCMS+P8組小鼠海馬BDNF和TrkB蛋白表達水平進一步降低（P<0.05）。RT-PCR結(jié)果與Western blotting類似。BDNF和TrkB mRNA在SAMR1組海馬的表達明顯高于SAMP8小鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。與P8組小鼠相比，UCMS+P8組小鼠海馬BDNF和TrkB mRNA的表達明顯下降（P<0.05），而R1組和UCMS+R1組之間海馬mRNA的表達無明顯差異

19、。結(jié)果表明UCMS后SAMP8小鼠海馬BDNF和TrkB mRNA及蛋白的表達下降。
　　第三部分：氟西汀對慢性應(yīng)激后SAMP8小鼠認知功能的影響及相關(guān)機制探討
　　目的：
　　利用UCMS小鼠模型研究SSRI藥物氟西汀對于應(yīng)激后相關(guān)認知功能障礙的治療作用，并探討相關(guān)機制。
　　方法：
　　1.采用6月齡雄性SAMR1及SAMP8小鼠，隨機分為四組:1）R1組（SAMR1小鼠不接受應(yīng)激處理）；2）P8組（S

20、AMP8小鼠不接受應(yīng)激處理）；3）UCMS組（SAMP8小鼠接受應(yīng)激處理）；4）Flu組（應(yīng)激的SAMP8小鼠接受氟西汀治療）。
　　2.慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激（UCMS）的干預(yù)及藥物治療UCMS組小鼠接受隨機排列的低強度的社會和環(huán)境應(yīng)激源的應(yīng)激處理，每天隨機挑選2-3種應(yīng)激源，連續(xù)應(yīng)激6周。應(yīng)激源同第一部分。
　　氟西汀用0.9％氯化鈉配置成終濃度2mg/ml。應(yīng)激2周后，氟西汀組的小鼠接受氟西汀腹腔注射，每周7天，連續(xù)治

21、療4周，氟西汀使用量為20mg/kg(10ml/kg)。其它組小鼠接受同等量的生理鹽水腹腔注射。
　　3.記錄在應(yīng)激操作開始前和應(yīng)激6周的應(yīng)激操作結(jié)束后（氟西汀治療結(jié)束后）行為學(xué)開始前的體重，分別記錄為應(yīng)激前和應(yīng)激后的體重，反應(yīng)小鼠的整體狀態(tài)。
　　4.氟西汀治療結(jié)束后，采用蔗糖偏愛實驗觀察各組小鼠的抑郁狀態(tài)，Morris水迷宮實驗觀察各組小鼠的認知功能。
　　5.行為學(xué)實驗后通過透射電子顯微鏡觀察各組小鼠海馬CA1區(qū)

22、神經(jīng)元及突觸的超微結(jié)構(gòu)。
　　6.蛋白印跡（Western blotting）實驗方法觀察各組小鼠海馬PSD95、SYN、BDNF和TrkB蛋白水平的表達及Bcl-2和Bax蛋白的表達。
　　7.RT-PCR實驗方法觀察各組小鼠海馬PSD95、SYN、BDNF和TrkB mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　1.應(yīng)激操作開始前，各組 SAMP8小鼠之間的體重?zé)o明顯差異（P>0.05）。應(yīng)激后，與SAMP8組的小鼠相比

23、，UCMS組小鼠體重明顯下降（P<0.05）；與UCMS組小鼠，F(xiàn)lu組小鼠的體重明顯增多（P<0.05）。以上結(jié)果說明，慢性應(yīng)激使SAMP8小鼠體重減輕，而給予氟西汀治療后小鼠體重增加。
　　2.蔗糖飲水實驗：與P8組相比，UCMS組小鼠的蔗糖偏愛值明顯下降（P<0.05）；與UCMS組相比，F(xiàn)lu組小鼠的蔗糖偏愛值明顯增多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。上述結(jié)果說明慢性應(yīng)激導(dǎo)致了SAMP8小鼠抑郁樣狀態(tài)的產(chǎn)生，而氟西汀的治

24、療改善了其抑郁表現(xiàn)。
　　3.MWM水迷宮實驗評價了各組小鼠海馬依賴性的空間學(xué)習(xí)記憶能力。定位巡航實驗結(jié)果顯示，與R1組小鼠相比，P8組小鼠的逃避潛伏期明顯延長（P<0.05）。然而，慢性應(yīng)激進一步增加了延長的逃避潛伏期（P<0.05，UCMS vs P8組），與UCMS組相比，F(xiàn)lu組小鼠的逃避潛伏期縮短（P<0.05）。在空間探索實驗中，我們撤去水下隱形平臺。與R1組小鼠相比，P8組小鼠穿越平臺的次數(shù)明顯減少，差異具有統(tǒng)計學(xué)意

25、義（P<0.05）；接受慢性應(yīng)激處理的SAMP8小鼠的穿越平臺次數(shù)進一步減少（P<0.05，UCMS+P8 vs P8組）；與UCMS組相比，F(xiàn)lu組小鼠的穿越平臺次數(shù)明顯增多（P<0.05）。上述結(jié)果說明慢性應(yīng)激進一步加劇了SAMP8小鼠的認知功能障礙，而氟西汀的治療改善了其認知功能的損傷。
　　4.氟西汀治療改善了慢性應(yīng)激后SAMP8小鼠腦內(nèi)海馬CA1區(qū)神經(jīng)元及突觸的受損情況。
　　5.與SAMR1小鼠相比， SAMP8

26、小鼠海馬PSD95和SYN蛋白和mRNA的表達降低（P<0.05）；與P8組相比，UCMS組小鼠海馬PSD95和SYN蛋白和mRNA的表達水平進一步降低（P<0.05）；與UCMS組相比，F(xiàn)lu組小鼠海馬 PSD95和 SYN蛋白和 mRNA的表達水平升高（P<0.05）。結(jié)果說明UCMS降低了SAMP8小鼠海馬PSD95和SYN蛋白和mRNA的表達，而氟西汀治療逆轉(zhuǎn)了應(yīng)激后蛋白和mRNA表達的變化。
　　6.與SAMR1小鼠相比

27、， SAMP8小鼠海馬BDNF和TrkB蛋白和mRNA的表達降低（P<0.05）；與P8組相比，UCMS組小鼠海馬BDNF和TrkB蛋白和mRNA的表達水平進一步降低（P<0.05）；與UCMS組相比， Flu組小鼠海馬 BDNF和 TrkB蛋白和 mRNA的表達水平升高（P<0.05）。結(jié)果說明UCMS降低了SAMP8小鼠海馬BDNF和TrkB蛋白和mRNA的表達，而氟西汀治療逆轉(zhuǎn)了應(yīng)激后BDNF和TrkB蛋白和mRNA表達的變化。<

28、br>　　7.氟西汀對各組小鼠海馬凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達的影響。與SAMR1小鼠相比，SAMP8小鼠海馬Bcl-2蛋白的表達降低（P<0.05）；與 P8組相比， UCMS組小鼠海馬 Bcl-2蛋白表達水平進一步降低（P<0.05）；與UCMS組相比，F(xiàn)lu組小鼠海馬Bcl-2蛋白表達水平升高（P<0.05）。與SAMR1小鼠相比，SAMP8小鼠海馬Bax蛋白的表達增多（P<0.05）；與P8組相比，UCMS組小鼠海馬Ba

29、x蛋白表達水平進一步增多（P<0.05）；與UCMS組相比，F(xiàn)lu組小鼠海馬Bax蛋白表達水平降低（P<0.05）。結(jié)果說明UCMS后SAMP8小鼠海馬Bcl-2蛋白的表達降低，海馬Bax蛋白表達升高，而氟西汀治療逆轉(zhuǎn)了慢性應(yīng)激后蛋白表達的變化。
　　結(jié)論：
　　1.SAMP8小鼠與SAMR1小鼠相比，其認知功能下降，神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)受損。行為學(xué)及電鏡結(jié)果顯示，連續(xù)4周的慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激對SAMR1小鼠的認知功能、

30、神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)無明顯影響，卻導(dǎo)致SAMP8小鼠的認知障礙加重，伴隨著神經(jīng)元及突觸超微結(jié)構(gòu)嚴重受損。說明慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激對兩種小鼠的認知功能及神經(jīng)病理的影響并不相同，6月齡SAMR1小鼠對慢性應(yīng)激具有良好的調(diào)控力，而同月齡SAMP8小鼠的應(yīng)激耐受力則出現(xiàn)明顯下降，提示老化的個體應(yīng)激耐受力下降，對應(yīng)激的損傷更加敏感。
　　2.與6月齡的SAMR1小鼠相比，同月齡的SAMP8小鼠接受慢性不可預(yù)知性溫和應(yīng)激后，海馬突觸相關(guān)蛋白

31、、BDNF-TrkB的表達進一步減少。在內(nèi)源性因素（老化）和外源性因素（UCMS作用）的共同作用下，老化小鼠表現(xiàn)出對應(yīng)激的耐受力降低，海馬突觸可塑性及BDNF-TrkB信號通路受損可能是慢性應(yīng)激后SAMP8小鼠認知功能下降的相關(guān)神經(jīng)生物學(xué)機制。我們的研究加強了對老年個體慢性應(yīng)激相關(guān)認知功能損害的認識，可能為認知功能障礙或癡呆的有效防治提供更多的理論依據(jù)。
　　3.本研究利用氟西汀治療改善了慢性應(yīng)激后SAMP8小鼠的抑郁狀態(tài)及認知功