SAMP8小鼠增齡性氧化應(yīng)激與炎癥相關(guān)蛋白表達及SS31肽的干預(yù)作用.pdf

1、目的：阿爾茨海默?。ˋlzheimerdisease，AD）是最常見的、與年齡相關(guān)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。其臨床特征主要表現(xiàn)為認知功能逐漸減退，日常生活能力不斷下降，并伴有行為障礙和神經(jīng)精神癥狀等；病理學(xué)特征主要表現(xiàn)為腦組織神經(jīng)元數(shù)量減少，細胞外β-淀粉樣蛋白（β-Amyloidpeptide，Aβ）沉積、顆?？张輼幼冃约吧窠?jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）等。65歲以上人群AD發(fā)病率高達7％～10%，給社會和家庭帶來了沉重負擔(dān)。因此，探討AD

2、的發(fā)病機制并尋求有效的治療藥物是當今醫(yī)學(xué)界研究的熱點。已有證據(jù)表明，該病的發(fā)病機制可能與老化、Aβ沉積、慢性神經(jīng)炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激有關(guān)。
　　Aβ蛋白是老年斑（senileplaques，SP）的主要成分，是AD病理和導(dǎo)致神經(jīng)退行性病變主要的致病分子。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB（nuclearfactorkappaB）可參與調(diào)控炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)中各種細胞因子和趨化因子的表達，引起炎性細胞的激活及炎性因子的釋放，進而調(diào)節(jié)細胞分裂和凋亡反

3、應(yīng)。核轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子（nuclearfactorerythroid2-relatedfactor2，Nrf2）是參與細胞氧化反應(yīng)的關(guān)鍵因子，通過激活Nrf2/ARE通路，調(diào)節(jié)一系列抗氧化反應(yīng)蛋白和Ⅱ相解毒酶的表達，發(fā)揮其抗氧化作用。
　　快速老化SAMP8（senescenceacceleratedmouseprone8,SAMP8）小鼠模型具有與AD相關(guān)的典型的行為學(xué)改變和病理學(xué)特征，被認為是研究AD病情發(fā)展過程中神

4、經(jīng)退行性改變及可能治療策略的理想動物模型。正常老化SAMR1（senescence-acceleratedmouse-resistant1,SAMR1）小鼠作為其正常對照模型。新型線粒體靶向抗氧化劑SS31肽（H-D-Arg-Dmt-Lys-Phe-NH2），易通過血腦屏障到達線粒體內(nèi)膜，具有清除氧自由基（reactiveoxygenspecies，ROS）、抗炎性反應(yīng)、保護線粒體和神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)的功能，但SS31的分子機制及將其應(yīng)用于

5、AD模型SAMP8小鼠的干預(yù)作用尚不十分明確。本實驗旨在探討4、8、12月齡SAMP8小鼠隨年齡增長出現(xiàn)的Aβ蛋白水平、NF-κB及Nrf2信號通路變化；8月齡SAMP8小鼠經(jīng)SS31肽干預(yù)8周后Aβ蛋白、NF-κB及Nrf2通路的表達變化情況，進一步探討SS31的干預(yù)作用，為AD的發(fā)病機制及治療方法提供新的思路。
　　方法：以25~32g雄性SAMP8及SAMR1小鼠為研究對象，小鼠均購自天津中醫(yī)藥大學(xué)，清潔級動物，于河北省人民

6、醫(yī)院臨床研究中心飼養(yǎng)，以標準鼠糧及飲用水喂養(yǎng)至合適月齡。實驗1：18只SAMP8小鼠隨機分為三組（n=6），分別喂養(yǎng)至4月齡（4Mgroup）、8月齡（8Mgroup）和12月齡（12Mgroup）。實驗2：8月齡SAMR1溶媒鹽水注射組（SAMR1vehiclegroup，n=6），作為正常對照組；8月齡SAMP8小鼠12只隨機分為2組：溶媒鹽水注射組（SAMP8vehiclegroup，n=6），作為快速老化對照組；SS31處理組（

7、SS31group，n=6），注射前應(yīng)先將SS31溶于生理鹽水中，濃度為1nM（該劑量已被證實為有效且無毒副作用）。以上三組均以5mg/kg/day的劑量連續(xù)腹腔注射8周。
　　取各組小鼠海馬組織，采用westernblot蛋白分析法測定Aβ42、NF-κBp65、HO-1的總蛋白表達量及Nrf2在胞核（nuclearNrf2，N-Nrf2）、胞漿（cytoplasmNrf2，C-Nrf2）中的蛋白表達量；采用RT-qPCR技術(shù)測

8、定NF-κB、Nrf2、HO-1的mRNA表達量。
　　結(jié)果：
　　1、快速老化過程中，SAMP8小鼠海馬組織Aβ42蛋白水平、NF-κB及Nrf2/ARE信號通路活性隨月齡增長呈現(xiàn)增高趨勢
　　1.1Aβ42的蛋白水平隨月齡增長表達增強
　　Aβ42的蛋白水平在4M，8M，12M呈逐漸增高趨勢，其中12M較4M增高明顯（P<0.05），表明神經(jīng)毒性物質(zhì)Aβ42在海馬組織隨月齡增長其蛋白表達逐漸增強（Fig.2B

9、）。
　　1.2NF-κBp65在快速老化過程中，其通路活性隨月齡增長逐漸增強
　　NF-κBp65基因表達和蛋白水平在4M，8M，12M呈逐漸增高趨勢，其中12M較4M明顯增高（P<0.05），表明NF-κB信號通路逐漸激活，炎癥反應(yīng)隨月齡增長逐漸加重（Fig.1A,Fig.2A）。
　　1.3Nrf2/ARE信號通路在快速老化過程中，隨月齡增長活性增加
　　Nrf2基因表達和N-Nrf2蛋白水平在4M，8M，

10、12M呈緩慢增高趨勢，而C-Nrf2蛋白水平則相應(yīng)減少；表明隨月齡增長，Nrf2表達增多，且逐漸由胞漿轉(zhuǎn)移至胞核中（Fig.1B，F(xiàn)ig.3A，B）。由Nrf2/ARE通路調(diào)控的Ⅱ相解毒酶HO-1的基因表達和蛋白水平與Nrf2趨勢相一致，表明Nrf2/ARE信號通路在老化過程中被逐漸激活，在一定程度上發(fā)揮其抗氧化功能（Fig.1C,Fig.2C）。
　　2、與SAMR1小鼠相比，同月齡SAMP8小鼠海馬組織Aβ蛋白水平增加、NF-

11、κB及Nrf2/ARE通路活性增強
　　2.1SAMP8小鼠Aβ蛋白水平增加、NF-κB通路激活
　　10月齡SAMP8小鼠較SAMR1小鼠海馬組織Aβ42蛋白水平及NF-κBp65基因表達和蛋白水平均明顯升高（均有P<0.05）。表明快速老化小鼠較正常小鼠Aβ蛋白沉積增加、NF-κB通路活化（Fig.1D,Fig.4A,B）。
　　2.2SAMP8小鼠Nrf2/ARE信號通路活性增加
　　10月齡SAMP8小鼠

12、較SAMR1小鼠海馬組織Nrf2、HO-1的基因表達增強，N-Nrf2、HO-1的蛋白水平升高，而C-Nrf2蛋白水平則相應(yīng)減少。表明Nrf2/ARE信號通路在快速老化小鼠中活性相對增強，一定程度上增加了組織的抗氧化能力（Fig.1D,E,Fig.4C,Fig.5A）。
　　3SS31能夠明顯降低SAMP8小鼠海馬組織Aβ蛋白水平、抑制NF-κB信號通路，激活Nrf2/ARE信號通路
　　3.1SS31能夠減少Aβ42蛋白沉

13、積
　　經(jīng)SS31干預(yù)8周后，Aβ42蛋白水平較SAMP8小鼠明顯降低（P<0.05），接近SAMR1小鼠的水平；表明SS31能夠顯著降低快速老化小鼠海馬組織Aβ42蛋白水平（Fig.4B）。
　　3.2SS31能夠抑制NF-κB信號通路，減輕炎癥反應(yīng)
　　經(jīng)SS31干預(yù)8周后，NF-κBp65的基因表達和蛋白水平均明顯降低（P<0.05），幾乎恢復(fù)到了SAMR1水平（P>0.05），表明SS31能夠明顯抑制快速老化小

14、鼠海馬組織NF-κB通路活性，減輕炎癥反應(yīng)（Fig.1D,Fig.4A）。
　　3.3SS31能夠激活Nrf2/ARE信號通路，增強抗氧化能力
　　經(jīng)SS31干預(yù)8周后，Nrf2、HO-1基因表達大幅增加，N-Nrf2、HO-1的蛋白水平明顯升高，表明SS31可使Nrf2/ARE信號通路大量激活，抗氧化能力增強。
　　結(jié)論：
　　1、快速老化過程中，SAMP8小鼠海馬組織Aβ42蛋白水平、NF-κB及Nrf2/A