氧化應(yīng)激與大鼠增齡性骨量減少關(guān)系的初步探究.pdf

1、研究背景:
　　 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種常見的骨代謝疾病,以骨量低下,骨微結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致骨脆性增加,易發(fā)生骨折為特征的全身性骨病。據(jù)2008年IOF(國際骨質(zhì)疏松基金會)統(tǒng)計,全球約有2億骨質(zhì)疏松患者,而我國2009年的骨質(zhì)疏松白皮書的調(diào)查顯示,我國OP患者大約為7000萬例,低骨量人群為2.1億例,可見,OP已成為全球公共衛(wèi)生問題。原發(fā)性骨質(zhì)疏松分為絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松(postmenopausal os

2、teoporosis)以及老年性骨質(zhì)疏松(senile osteoporosis),老年性骨質(zhì)疏松是機(jī)體自然衰退、老化過程的組成部分,其發(fā)病與衰老、性腺機(jī)能減退、遺傳、內(nèi)分泌、營養(yǎng)、物理等因素相關(guān)。老年期的骨量丟失合并骨轉(zhuǎn)換的減慢是老年性骨質(zhì)疏松癥的主要病理表現(xiàn),年齡和性腺機(jī)能減退是影響其發(fā)生的兩個決定性因素。20世紀(jì)40年代已明確雌激素缺乏是骨質(zhì)疏松癥的因?yàn)橹?但雌激素導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制仍不完全清楚。而在對衰老的病因研究中,衰老自

3、由基學(xué)說認(rèn)為活性氧(reactive oxygen species,ROS)是引起衰老的重要因?yàn)?。提示機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化失衡而導(dǎo)致的氧化應(yīng)激(oxidative stress,OS)可能是老年性骨質(zhì)疏松癥的因?yàn)橹弧?br>　　 ROS是生物體內(nèi)有氧代謝產(chǎn)生的含氧自由基,主要包括超氧陰離子(O2-)、羥基(-OH)和過氧化氫(H2O2)。正常生理狀態(tài)下,體內(nèi)ROS不斷產(chǎn)生的同時被保護(hù)酶如超氧化物歧化酶(superoxide dismu

4、tase,SOD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GP)及一些低分子量抗氧化劑清除。當(dāng)機(jī)體防御系統(tǒng)功能低下時,體內(nèi)氧化與抗氧化作用失衡,傾向于氧化,出現(xiàn)了OS狀態(tài)。異常增多的ROS對生物機(jī)體造成一系列的氧化損傷,如攻擊多聚不飽和脂肪酸引起脂質(zhì)過氧化,使生物膜的結(jié)構(gòu)、功能及細(xì)胞膜表面受體改變；損傷蛋白質(zhì)的巰基和氨基,使蛋白質(zhì)變性、交聯(lián)、酶的活性喪失；損傷DNA,導(dǎo)

5、致DNA鏈的斷裂及突變等。
　　 ROS增高所導(dǎo)致的OS狀態(tài)將會對人體造成巨大的損傷。而自由基的負(fù)性作用主要是由于其結(jié)構(gòu)中含有未成對電子,具有高度反應(yīng)性,能夠迅速與周圍物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)。這種高度反應(yīng)性決定了其半衰期非常短暫,直接測量這些自由基水平非常困難。但是,自由基與分子(脂類、蛋白質(zhì)、DNA)發(fā)生反應(yīng)后的氧化產(chǎn)物,可以作為反映氧化應(yīng)激水平標(biāo)志物。
　　 自由基可以引起蛋白質(zhì)的交聯(lián)聚合和肽鏈斷裂,使蛋白質(zhì)與脂質(zhì)結(jié)合形成聚合

6、物,從而使蛋白質(zhì)功能喪失。自由基攻擊蛋白分子的側(cè)鏈氨基酸,如賴氨酸、精氨酸、脯氨酸、蘇氨酸,可以產(chǎn)生相應(yīng)蛋白衍生物,并引起體內(nèi)蛋白巰基水平下降。吞噬細(xì)胞產(chǎn)生的次氯酸(強(qiáng)氧化劑)可以使血漿白蛋白氧化成晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein products,AOPP)以及糖化蛋白被氧化修飾成的晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGE),均可作為蛋白質(zhì)氧化損傷

7、的標(biāo)志物。而自由基作用于生物膜上的不飽和脂肪酸,引起膜脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)而轉(zhuǎn)變成過氧化脂質(zhì),導(dǎo)致膜的流動性改變,使細(xì)胞變形能力下降、脆性增加,影響膜受體離子通道功能,增加膜通透性。脂質(zhì)過氧化的同時還可以增加新的自由基以及導(dǎo)致晚期脂氧化產(chǎn)物如丙二醛(malonaldehyde,MDA)、4-羥基壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal,4-HNE)、氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,o

8、x-LDL)和異前列腺素等的產(chǎn)生自由基可以與堿基發(fā)生加成反應(yīng),對堿基進(jìn)行修飾,從而引起基因突變,甚至導(dǎo)致DNA鏈的斷裂。如鳥嘌呤被氧化生成8-氧代鳥嘌呤,在修復(fù)酶作用下以8-羥基脫氧鳥苷形式被切除。氧自由基可以使膠原纖維的膠原蛋白發(fā)生交聯(lián),使透明質(zhì)酸降解等,從而破壞細(xì)胞外基質(zhì)。
　　 AOPP是1996年首先由Witko Sarsat等提出,它是通過氯化氧化反應(yīng)在氧化應(yīng)激過程由吞噬細(xì)胞激活生成的次氧酸或氯胺對血清白蛋白氧化作用生

9、成的含雙酪氨酸的蛋白交連物。已知分葉核中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在特定的刺激下能夠產(chǎn)生呼吸爆發(fā),而后者可以導(dǎo)致高活性的ROS大量產(chǎn)生。在ROS的形成中,吞噬細(xì)胞具有在髓過氧化酶的作用下生成含氯氧化物的能力。髓過氧化酶在氯離子存在的情況下,使過氧化氫生成次氯酸。次氯酸是吞噬細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性最強(qiáng)和化學(xué)性質(zhì)最活潑的一類物質(zhì),AOPP即是氯氧化物和血漿蛋白之間的反應(yīng)產(chǎn)物。AOPP作為炎癥遞質(zhì)能夠觸發(fā)氧化爆發(fā)并促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞合成炎性細(xì)胞因子。

10、研究表明,AOPP的產(chǎn)生以及增加存在于多種病理狀態(tài),包括糖尿病、尿毒癥、慢性腸道炎性疾病以及肥胖癥等,提示AOPP的增加可能與體內(nèi)病理生理環(huán)境有關(guān)。AOPP作為新的尿毒癥毒素和炎癥遞質(zhì),可作為一個測定氧化劑介導(dǎo)的蛋白損害的可靠指標(biāo),能夠評價針對降低氧化應(yīng)激治療的效果。
　　 MDA是由體內(nèi)產(chǎn)生的氧自由基侵害細(xì)胞質(zhì)中的不飽和脂肪酸,使得其中兩個或以上的亞甲基雙鍵斷裂形成脂質(zhì)自由基,引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)而產(chǎn)生的物質(zhì)。過多的MDA能與蛋

11、白、核酸等大分子形成脂褐質(zhì)沉積于細(xì)胞中,這是導(dǎo)致機(jī)體細(xì)胞衰老的重要因?yàn)?。同時,它還可與磷脂蛋白發(fā)生反應(yīng),改變細(xì)胞膜的通透性,造成組織細(xì)胞的損傷。MDA因其是脂質(zhì)過氧化代謝的毒性產(chǎn)物,它的含量直接反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的速率和強(qiáng)度。因此,常作為判斷自由基損害程度的指標(biāo),間接反映細(xì)胞受氧自由基損害的程度。
　　 1938年Mann和Keilin首次從牛紅細(xì)胞中分離出一種藍(lán)色的含銅蛋白質(zhì),1969年Mccord及Fridovich發(fā)現(xiàn)該蛋

12、白有催化超氧陰離子,發(fā)生歧化反應(yīng)的功能,故將此酶命名為超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)。SOD作用底物是超氧陰離子自由基,它既帶一個負(fù)電荷,又只有一個未成對的電子,有毒性的自由基在SOD和過氧化氫酶共同作用下,變成了無毒的H2O和O2。正常生命過程中產(chǎn)生的超氧陰離子自由基是維持生命所必需的,但濃度過高時,對機(jī)體也會造成損害。該酶作為特異性清除劑,催化超氧陰離子的歧化反應(yīng),能夠平衡機(jī)體氧自由基,從而避免體

13、內(nèi)超氧陰離子自由基濃度過高時引起的不良反應(yīng),常被看作為活性氧防御的第一線；當(dāng)SOD含量和活力的減少和降低,將導(dǎo)致自由基堆積,出現(xiàn)氧化應(yīng)激狀態(tài),對機(jī)體產(chǎn)生巨大的損害。因此,SOD作為體內(nèi)一種重要氧自由基清除劑,在機(jī)體的生命活動中具有重要意義；與此同時,它也是體內(nèi)反映抗氧化狀態(tài)的重要指標(biāo)。
　　 目的:
　　 探討氧化應(yīng)激與大鼠增齡性骨量減少之間的關(guān)系,為老年性骨質(zhì)疏松癥的臨床干預(yù)提供理論依據(jù)。
　　 方法:

14、　　 選用2、9及18月齡雄性Wistar大鼠各20只,按月齡分為幼年、成年、老年3組。取血后處死大鼠,采用比色法檢測血清及勻漿上清中氧化指標(biāo)晚期氧化蛋白產(chǎn)物(AOPP)、丙二醛(MDA)含量和抗氧化指標(biāo)超氧化物歧化酶(SOD)活力。取左側(cè)股骨,用雙光子骨密度儀測定大鼠離體股骨骨密度值。另每組選取6只Wistar大鼠,取左側(cè)脛骨進(jìn)行骨組織形態(tài)計量動靜態(tài)學(xué)參數(shù)檢測,其包括:骨小梁面積百分?jǐn)?shù)(％Tb.Ar),骨小梁厚度(Tb.Th),骨小

15、梁數(shù)量(Tb.N),骨小梁分離度(Tb.SP),動態(tài)參數(shù)包括熒光標(biāo)志周長百分?jǐn)?shù)(％L.Pm),礦化沉積率(MAR),骨表面骨形成率(MS/BS),骨小梁周長形成率(BFR/BS),骨小梁面積形成率(BFR/BV),骨小梁體積形成率(BFR/TV)。
　　 結(jié)果:
　　 (1)與幼年組、成年組相比,老年組骨密度顯著降低(P<0.01),而幼年組與成年組之間無顯著性差異(P>0.05)。
　　 (2)各組骨組織形態(tài)計

16、量學(xué)指標(biāo)中,老年組與幼年組、成年組相比,Tb.SP增加顯著(P<0.05),而Tb.Th、MAR、MS/BS、BFR/BS以及BFR/BV下降明顯(P<0.05或P<0.01)。
　　 (3)血清指標(biāo)中,老年組與幼年組、成年組比較,AOPP、MDA含量升高(P<0.01),而幼年組與成年組之間無顯著性差異(P>0.05),SOD活力則顯示隨年齡的增加而下降(P<0.05)；股骨骨密度與AOPP含量之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.64

17、0；p<0.01)；與MDA含量負(fù)相關(guān)(r=-0.421;p<0.01),與SOD活力正相關(guān)(r=0.470；p<0.01)；
　　 (4)股骨組織方面,AOPP含量隨年齡的增加而升高(P<0.01)；老年組與成年組、幼年組比較,MDA含量增高(P<0.05),而成年組和幼年組之間無顯著性差異(P>0.05)；股骨骨密度與AOPP含量之間呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.595；p<0.01)；與SOD活力正相關(guān)(r=0.353；p<0.