人巨細(xì)胞病毒抗原表位的重組表達(dá)及重組蛋白的抗原特性分析.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒（Human cytomegalovirus，HCMV）在自然界中廣泛存在，屬于皰疹病毒科的雙鏈DNA病毒。研究表明，HCMV參與多種疾病的發(fā)生，尤其易造成免疫系統(tǒng)缺陷人群的感染以及胎兒的感染。由于HCMV感染所引發(fā)的嚴(yán)重疾病日益增加，學(xué)者開始致力于研究關(guān)于HCMV感染的防治工作。HCMV的藥物治療方法會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的副作用，因此制備HCMV疫苗是當(dāng)下防治HCMV最有效的方法。包膜糖蛋白B（Glycoprotein B，gB）和

2、外被磷蛋白65（Phosphoprotein65，pp65）是目前研究最多的，也是被證明能分別產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)的兩種靶蛋白。
　　根據(jù)文獻(xiàn)及生物信息學(xué)方法分析，pp65蛋白的490-508位氨基酸序列和gB蛋白的607-621位氨基酸序列具有較強(qiáng)的免疫原性，是HCMV的免疫優(yōu)勢(shì)表位。本研究分別選取pp65蛋白的490-508aa和gB蛋白的607-621aa的基因片段，人工合成編碼基因；以合成編碼基因序列作為模板，

3、經(jīng)PCR擴(kuò)增后，連接表達(dá)載體pET-32a(+)，轉(zhuǎn)化BL21(DE3)plys菌株，表達(dá)成融合蛋白，通過Ni柱親和層析法純化目的蛋白，得率為30.5%。純化后的重組蛋白免疫Balb/c小鼠，分離血清，Western blotting法測(cè)抗體的特異性，結(jié)果顯示抗體具有較好的特異性。間接ELISA法測(cè)得抗體的效價(jià)為1:102400，建立了HCMV間接ELISA檢測(cè)方法。結(jié)果顯示重組蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。用流式細(xì)胞儀測(cè)得免疫

4、后小鼠外周血中CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的數(shù)量分別是48.65%和16%，與對(duì)照組（38.05%和13.15%）相比，數(shù)量有顯著提高(P<0.01)；用雙抗夾心ELISA法測(cè)得小鼠血清中IFN-γ，IL-2，IL-12的含量分別是2.39 pg/L，87.07 ng/L，188.02 ng/L，與對(duì)照組（1.85 pg/L，52.95 ng/L，88.51 ng/L）相比，含量有顯著提高(P<0.01)。因此重組蛋白能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生較