細(xì)胞周期調(diào)控蛋白cyclin D1基因靶向microRNAs的預(yù)測(cè)、系統(tǒng)驗(yàn)證及西洋參提取物處理人乳腺癌細(xì)胞的表達(dá)譜分析.pdf

1、本論文的研究分兩個(gè)部分。第一階段基本圍繞害蟲生防真菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的關(guān)鍵因素開展研究，目的是優(yōu)化球孢白僵菌芽生孢子轉(zhuǎn)化體系，提高轉(zhuǎn)化效率，以服務(wù)于生防真菌的基因操作和菌種（株）的分子定向選育。第二階段的工作是執(zhí)行教育部的博士研究生交流計(jì)劃，在美國南伊利諾斯大學(xué)開展合作研究，由美國的合作導(dǎo)師莫寅元副教授安排從事腫瘤發(fā)生發(fā)展microRNA(miRNA)調(diào)控機(jī)制研究，開展了miRNA靶基因搜索與驗(yàn)證、miRNA表達(dá)譜分析兩方面的工作。主要結(jié)果

2、如下：
　　 CCND1基因靶向miRNA的預(yù)測(cè)與雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)驗(yàn)證基于miranda軟件(http://www.microRNA.org)的預(yù)測(cè)，克隆到58種pre-miRNA中的51種CCND1基因靶向miRNA，通過表達(dá)載體構(gòu)建(pCDH-CMV-MCS-EFl-copGFP)和真核細(xì)胞表達(dá)，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其中的45種pre-miRNA的表達(dá)水平相對(duì)較高。7種miRNA可使雙熒光素酶報(bào)告基因系

3、統(tǒng)中熒光素酶相對(duì)活性下將35％以上，顯示miranda軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的陽性率約為16％。在7種可下調(diào)熒光素酶表達(dá)的miRNA中，miR-16、miR-34a、miR-195和miR-424a對(duì)CCND1基因的沉默作用已見報(bào)道，而miR-19a、miR-155和miR-503為首次發(fā)現(xiàn)。比較miRanda、TargetScan和PicTar軟件預(yù)測(cè)的CCND1基因靶向miRNA，三種軟件預(yù)測(cè)結(jié)果的交集陽性率最高，但僅由miRanda軟件預(yù)測(cè)

4、的miRNA中仍存在可能的靶向miRNA，突出了對(duì)其進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的必要性。預(yù)測(cè)結(jié)果的較低陽性率，揭示了miRNA/mRNA相互作用的復(fù)雜性。
　　 CCNDI基因靶向miRNA的系統(tǒng)驗(yàn)證應(yīng)用Western雜交和實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)篩選到的3種CCND1基因靶向miRNA(miR-19a,miR-155和miR-503)對(duì)人頭頸部腫瘤細(xì)胞UMSCC10B表達(dá)CCND1蛋白和mRNA的影響。結(jié)果顯示，m

5、iR-503在UMSCC10B細(xì)胞中可顯著降低CCND1蛋白和mRNA的表達(dá)。為了驗(yàn)證miR-503沉默CCND1基因的特異性，使用anti-miR-503和熒光素酶報(bào)告基因載體共轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞293T，結(jié)果導(dǎo)致熒光素酶相對(duì)活性顯著上升，與miR-503轉(zhuǎn)染時(shí)相反。兩個(gè)miR-503預(yù)測(cè)靶位點(diǎn)被敲除后，雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)未見相對(duì)熒光素酶活性的明顯變化。這證明miR-503可通過與這兩個(gè)位點(diǎn)的特異結(jié)合沉默CCND1基因。而且，mi

6、R-503可在UMSCCIOB細(xì)胞中降低S期細(xì)胞比例和抑制細(xì)胞生長，故推測(cè)miR-503可能為抑癌基因。
　　 西洋參提取物處理人乳腺癌細(xì)胞的miRNA表達(dá)譜分析用0.5、0.75和1.0 mg/mL西洋參提取物分別處理MDA-MB-231人乳腺癌細(xì)胞，在不同時(shí)間點(diǎn)觀察可見細(xì)胞形態(tài)發(fā)生較明顯的改變，表現(xiàn)為細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)粗糙。從0.5 mg/mL西洋參提取物處理24h后的樣品和對(duì)照樣品中提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR陣

7、列。在檢測(cè)的95種腫瘤相關(guān)miRNA中，發(fā)現(xiàn)miR-145和miR-205的表達(dá)分別上調(diào)3.2倍和4.5倍，miR-196a的表達(dá)下調(diào)82％。
　　 限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)法和電擊法優(yōu)化球孢白僵菌芽生孢子轉(zhuǎn)化體系采用限制性內(nèi)切酶介導(dǎo)整合(REMI)和電擊法優(yōu)化球孢白僵菌芽生孢子轉(zhuǎn)化體系。在薩氏培養(yǎng)液中振蕩培養(yǎng)48h后轉(zhuǎn)到合成培養(yǎng)基GM(w/v:4％葡萄糖、0.4％ NH4N03、0.3％ KH2P04和0.3％ MgS04)中培養(yǎng)_<

8、24 h，所獲芽生孢子用100 UHindlII或XbaI介導(dǎo)含草丁膦(PPT)抗性基因bar的1ug質(zhì)粒，具有良好的轉(zhuǎn)化效果。同樣孢齡的芽生孢子也適合電擊轉(zhuǎn)化，電場(chǎng)強(qiáng)度優(yōu)化為10 kV/cm。優(yōu)化的REMI法和電擊法可使轉(zhuǎn)化效率分別提高至38.5(±4.4)和52.7(±4.8)個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug DNA，而對(duì)照PEG法的轉(zhuǎn)化效率僅為22.2(+1.7)個(gè)轉(zhuǎn)化子/ug DNA，轉(zhuǎn)化效率提高了73％和137％。轉(zhuǎn)化子經(jīng)連續(xù)三代無選擇壓培養(yǎng)后

9、仍能在400 ug/mL PPT的察氏培養(yǎng)基平板上生長，而親本菌株未見抗性。PCR反應(yīng)和Southern雜交鑒定隨機(jī)選取的10個(gè)REMI和電擊轉(zhuǎn)化子，目的基因均成功插入其基因組中。
　　 綜上所述，本研究的主要成果和創(chuàng)新點(diǎn)，一是系統(tǒng)驗(yàn)證了CCND1基因靶向miRNA，篩選出特異性沉默CCND1基因的miRNA-503，推測(cè)其為抑癌基因；二是通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR陣列檢測(cè)到西洋參提取物誘導(dǎo)的miR-145、miR-205和miR-