PinX1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞MCF-7增殖的作用及其在細(xì)胞周期中的定位研究.pdf

1、乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，全世界每年約有130萬婦女患乳腺癌，50萬人死于乳腺癌，其發(fā)病率逐年上升，目前國內(nèi)約有47萬患者，成為婦女健康的最大威脅，在一些城市乳腺癌已成為婦女惡性腫瘤發(fā)病的首位。乳腺癌的治療包括手術(shù)治療、內(nèi)分泌治療、放射治療、化學(xué)治療和分子靶向治療等方法。近年來雖然放療及化療在設(shè)備和技術(shù)上取得了很大的進(jìn)步，但乳腺癌的5年生存率仍然不高。此外，放療和化療造成的局部及全身副作用導(dǎo)致病人的身心都承受極大的傷害，未能從根

2、本上改善治療效果。因此，探索乳腺癌的病因及新的安全有效的治療方法成為乳腺癌治療的瓶頸。惡性腫瘤的發(fā)生和侵襲轉(zhuǎn)移過程受多層次、多因素調(diào)控，癌基因與抑癌基因作用的失衡是其中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。因此，尋找新的或進(jìn)一步揭示已有癌基因或抑癌基因的功能，對闡明惡性腫瘤發(fā)生和演進(jìn)機(jī)理、研發(fā)潛在治療靶點具有重要意義。
　　 端粒，位于真核細(xì)胞染色體末端，是一種特殊的由富含G堿基的重復(fù)DNA序列與相關(guān)蛋白質(zhì)組成的復(fù)合體，保護(hù)末端染色體不被降解和防止染

3、色體末端融合，對維持細(xì)胞基因組的穩(wěn)定性有重要作用。在大多數(shù)細(xì)胞中，端粒長度主要由一種特殊的RNA逆轉(zhuǎn)錄酶一端粒酶以及端粒相關(guān)蛋白調(diào)節(jié)，端粒相關(guān)蛋白通過直接或間接與端粒DNA相互作用來維持端粒結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定。由于存在末端復(fù)制問題，即隨著細(xì)胞分裂，DNA每復(fù)制一次，都伴隨有末端端粒的部分丟失。如此，端粒將發(fā)生進(jìn)行性縮短，當(dāng)端?？s短到一定程度時，失去端粒保護(hù)的染色體將變得不穩(wěn)定，致使細(xì)胞進(jìn)入不安全狀態(tài)，出現(xiàn)凋亡、死亡等改變。端粒酶可以不斷補(bǔ)

4、充DNA復(fù)制所造成的端粒丟失，因而端粒的長度并不會隨著復(fù)制而發(fā)生進(jìn)行性縮短，從而維系細(xì)胞穩(wěn)定。端粒功能的缺失很可能導(dǎo)致細(xì)胞基因組的不穩(wěn)定，使細(xì)胞進(jìn)入不正常狀態(tài)，正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞的風(fēng)險也隨之大大增加。近幾年來，還有越來越多研究表明傳統(tǒng)的端粒蛋白不僅僅定位在端粒末端，保護(hù)正常的端粒結(jié)構(gòu)，有些還直接參與細(xì)胞有絲分裂進(jìn)程的復(fù)雜調(diào)控，例如端粒相關(guān)蛋白TERF1（Telomeric repeat-binding factor1），TERF1的蛋

5、白表達(dá)量在整個細(xì)胞周期中呈現(xiàn)動態(tài)變化，此外，TERF1能夠和微管，微管相關(guān)蛋白EB1以及一些重要的紡錘體檢驗點蛋白比如Madl，NekZ以及P1k1等相互作用。
　　 包括乳腺癌在內(nèi)的絕大多數(shù)惡性腫瘤與端粒酶活性及其亞單位hTERT(human telomerase reverse transcriptase)活性增高有密切關(guān)系。隨著對端粒酶研究的深入，以端粒酶為靶點，進(jìn)行腫瘤靶向基因治療成為有前景的治療方法之一，因而，探尋端粒

6、酶抑制劑成為新的熱點研究之一。PinX1為2001年報導(dǎo)，應(yīng)用酵母雙雜交方法，以細(xì)胞周期蛋白Pin2為誘餌，在人類宮頸癌細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的一個能與端粒/端粒酶相互作用的保守核仁蛋白。人PinX1(PinX1，humanPinX1)基因定位于染色體的8p23，是一處在多種腫瘤中發(fā)生高頻雜合缺失的區(qū)域。PinX1蛋白全長328aa，N-端(aa1-142)和C-端(aa254-328)各含一個hTERT結(jié)合位點。PinX1是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)力的

7、端粒酶抑制因子，PinX1的端粒酶抑制作用通過其本身與hTERT和hTR直接作用來實現(xiàn)，盡管如此，Pinx1在酵母中的同源物Gno1p中是否具有端粒酶抑制作用目前還存在爭議。高表達(dá)PinX1 C-端片斷對細(xì)胞端粒酶活性有顯著抑制作用，縮短端粒長度并抑制端粒酶陽性癌細(xì)胞生長。因此，PinX1被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)在的端粒酶抑制因子和潛在的抑癌基因，但PinX1對細(xì)胞端粒酶/端粒的具體調(diào)控機(jī)制及在腫瘤中的意義仍不清楚。此外，PinX1還被證明可以與

8、端粒蛋白TERF1相互作用，有研究表明，PinX1在端粒陽性腫瘤中可以增強(qiáng)TERF1在核仁的定位，但其具體作用發(fā)生機(jī)制還未被具體闡明。
　　 雖然PinX1被認(rèn)為是強(qiáng)的端粒酶抑制因子和潛在的抑癌基因，但是PinX1在腫瘤中的發(fā)揮的具體作用和作用機(jī)制仍存在爭論。國內(nèi)外都有研究表明，PinX1在胃癌和肝癌中表達(dá)量明顯下降，但在前列腺癌中卻未發(fā)現(xiàn)有下降的異常表達(dá)。同是在肝癌組織中，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)PinX1可以發(fā)揮調(diào)節(jié)端粒酶長度的作用，但對

9、癌的形成并無影響。甚至有研究表明，在急性白血病中，端粒酶的長度與PinX1表達(dá)量呈正相關(guān)的關(guān)系。PinX1可能在不同的腫瘤中參與的作用機(jī)制不同，所以發(fā)揮的作用也各有差異。關(guān)于PinX1與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，大多數(shù)學(xué)者傾向于認(rèn)為PinX1在乳腺癌中具有抑癌作用，但該結(jié)論仍未得到一致認(rèn)同，存在較大的爭論。本文主要研究該基因在乳腺癌中的表達(dá)情況，分析其對乳腺癌細(xì)胞MCF-7增殖情況和細(xì)胞周期的影響，觀察PinX1蛋白在不同周期中的定位和檢測

10、其在不同周期的表達(dá)量變化，結(jié)合文獻(xiàn)查找，推測其在MCF-7細(xì)胞周期調(diào)控中發(fā)揮的作用。本文研究的內(nèi)容主要包括一下四個部分:
　　 第一部分:針對PinX1的CDS區(qū)設(shè)計合成引物。從外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)中提取總RNA，通反轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增獲得目的基因片段。EcoRⅠ/XhoⅠ雙酶切及T4連接酶連接將其插入PDsRed1-C1質(zhì)粒克隆微點中。通過質(zhì)粒PCR及雙酶切篩選并鑒定出陽性重組質(zhì)粒，DNA送測序鑒定Pinx1序列的保真性

11、，將成功構(gòu)建的PDsRed1-C1-Pinx1真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞株MCF-7，以合適濃度G418進(jìn)行篩選，獲得穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞。熒光定量PCR和Western-Blot驗證Pinx1在穩(wěn)定表達(dá)系中的表達(dá)情況。
　　 第二部分:通過細(xì)胞增殖（MTT法），細(xì)胞集落形成，計算后期染色體橋(anaphase-bridge)檢測PinX1對乳腺癌細(xì)胞MCF-7的增殖，凋亡以及細(xì)胞周期的影響。
　　 第三部分:穩(wěn)定表達(dá)系MCF-7細(xì)

12、胞爬片后固定，DAPI染色，熒光顯微鏡下觀察不同周期中Pinx1的定位;饑餓法收集不同周期的細(xì)胞，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，熒光定量PCR檢測不同周期中Pinx1的表達(dá)量。推測Pinx1在乳腺癌細(xì)胞MCF-7細(xì)胞中參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的機(jī)制。
　　 上調(diào)Pinx1基因表達(dá)可以顯著抑制MCF-7細(xì)胞的增殖，anaphase-bridge的計算結(jié)果從側(cè)面證實Pinx1對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用。Pinx1的定位觀察實驗發(fā)現(xiàn)了P

13、inx1在不同周期定位的差異，對Pinx1在不同周期的表達(dá)量檢測揭示了Pinx1在不同細(xì)胞周期呈動態(tài)表達(dá)。
　　 本研究運(yùn)用RT-PCR成功克隆其基因片段，構(gòu)建得到PDsRed1-C1重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染MCF-7乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行持續(xù)、穩(wěn)定表達(dá)。在MCF-7細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)Pinx1，通過增殖，凋亡以及anaphase-bridge檢測實驗證實了Pinx1對MCF-7細(xì)胞增殖的抑制作用。Pinx1定位分析和熒光定量PCR表明Pinx1