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1、T細(xì)胞膜上電壓門控鉀通道Kv1.3是治療自身免疫疾病的新型靶蛋白。當(dāng)效應(yīng)T細(xì)胞上的Kv1.3表達(dá)量異常增高時(shí),可以引起T細(xì)胞的異常激活、增殖和分化,這一病理生理變化與自身免疫疾病的發(fā)生密切相關(guān),特異性強(qiáng)的Kv1.3阻斷劑有望成為治療自身免疫疾病的先導(dǎo)化合物。蝎子毒腺分泌大量離子通道調(diào)節(jié)肽,其中Kv1.3通道阻斷肽尤其豐富。
本研究提取波氏琵蝎毒腺總RNA,經(jīng)深圳華大基因公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到一條新的蝎毒素多肽KTX-Sp4編
2、碼基因,序列比對(duì)表明KTX-Sp4與已報(bào)到的Kv1.3通道阻斷肽高度同源,提示 KTX-Sp4可能是一種新的Kv1.3通道阻斷劑。本課題采用基因工程技術(shù),對(duì)KTX-Sp4進(jìn)行overlap PCR的基因擴(kuò)增,經(jīng)酶切、連接、轉(zhuǎn)化,構(gòu)建了pGEX-4T-1-KTX-Sp4重組表達(dá)載體,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌 E.coli/Rosetta(DE3)中。添加 IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)GST-KTX-Sp4融合蛋白,采用GST親和層析的方法對(duì)GST-
3、KTX-Sp4蛋白進(jìn)行純化,超濾洗脫鹽分并濃縮,運(yùn)用小腸激酶對(duì)GST-KTX-Sp4蛋白切割,經(jīng)RP-HPLC分離純化,得到成熟肽KTX-Sp4,結(jié)合MALDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定,測(cè)定的KTX-Sp4分子量與理論值基本吻合,表明成功制備出KTX-Sp4成熟肽。采用全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)技術(shù),測(cè)定KTX-Sp4成熟肽對(duì)Kv1.3通道的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)KTX-Sp4對(duì)外源表達(dá)在HEK-293細(xì)胞膜上Kv1.3通道電流表現(xiàn)出濃度依賴性抑制作用,1
4、00nM的KTX-Sp4對(duì)Kv1.3通道電流抑制過半, Hill方程擬合量效曲線得到其半數(shù)抑制濃度(IC50)為27.31±11.6nM。為研究KTX-Sp4對(duì)Kv1.3通道是否有選擇抑制作用,本課題進(jìn)一步觀察KTX-Sp4分別對(duì)小鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞膜上內(nèi)源性電壓門控性鉀通道(DRG Kv)、HEK-293細(xì)胞膜上外源性表達(dá)的Kv1.1和Kv1.2調(diào)節(jié)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),即使施加1μM高濃度,KTX-Sp4對(duì)DRG Kv、Kv1.1、Kv1.
5、2并沒有產(chǎn)生明顯的抑制作用,表明KTX-Sp4對(duì)Kv1.3通道具有較高的選擇性抑制作用。在哺乳動(dòng)物所有離子通道類型中,Kv1.1和 Kv1.3同源性最高,通道turret區(qū)域氨基酸殘基差異可以很好解釋部分活性多肽對(duì)二者的選擇性阻斷作用。既然KTX-Sp4對(duì)Kv1.3的抑制作用顯著強(qiáng)于Kv1.1,本課題擬初步從分子水平闡明KTX-Sp4對(duì)Kv1.1和Kv1.3通道的選擇性作用機(jī)制。當(dāng)將Kv1.1通道turret區(qū)域氨基酸殘基用Kv1.3通
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