慢病毒介導(dǎo)的MMP-3shRNA轉(zhuǎn)染對人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng).pdf

1、目的：體外篩選設(shè)計并合成的抑制效率最佳的MMP-3shRNA慢病毒載體，并觀察其對人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。
　　方法：采用酶序貫消化法對臨床腰椎間盤突出癥患者需行摘除術(shù)來源的髓核組織進(jìn)行分離、單層原代細(xì)胞培養(yǎng)，應(yīng)用細(xì)胞免疫組化法、細(xì)胞免疫熒光法等方法對髓核細(xì)胞進(jìn)行鑒定；根據(jù)人MMP-3基因mRNA序列設(shè)計合成4對不同的MMP-3 shRNA序列，與酶切后LV3載體鏈接并轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞，通過PCR和基因測序?qū)U(kuò)增的陽性克隆進(jìn)行鑒

2、定，對慢病毒進(jìn)行包裝和滴度測定；通過熒光定量PCR、Western Blot分別檢測轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞后MMP-3、Ⅱ型膠原、蛋白多糖基因和蛋白質(zhì)水平的變化，從而篩選最佳抑制序列慢病毒載體及其對人退變髓核細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)。
　　結(jié)果：原代髓核細(xì)胞呈三角形、多角形或短梭形等不規(guī)則形狀，細(xì)胞核較大，培養(yǎng)約3周時，原代髓核細(xì)胞匯合可達(dá)80％以上；蘇木精-伊紅染色細(xì)胞核呈藍(lán)色，胞漿呈淡紅色，甲苯胺藍(lán)染色胞核成深藍(lán)色，胞漿呈淡藍(lán)色，細(xì)胞免疫

3、組化及細(xì)胞免疫熒光Ⅱ型膠原分別呈黃褐色和綠色熒光。經(jīng)酶切鑒定陽性擴(kuò)增片段正確，基因測序顯示與設(shè)計序列完全相符，滴度檢測顯示大于1x108TU/ml。MMP3shRNA慢病毒轉(zhuǎn)染72和96小時后從 MMP-3基因和蛋白水平綜合篩選得出MMP-3shRNA3為最佳抑制序列（P<0.05）。MMP-3shRNA3轉(zhuǎn)染人退變髓核細(xì)胞5天后檢測Ⅱ型膠原和蛋白多糖mRNA及蛋白水平均增加（P<0.01）。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建并篩選出抑制效率最