新型乙腦-登革4嵌合病毒的構建與生物學性質(zhì)評價.pdf

1、登革病毒（dengue virus)屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈的 RNA病毒，全長約11kb，含有一個單一的開放讀碼框，開放讀碼框可依次編碼3種結(jié)構蛋白（C、PrM和E）和7種非結(jié)構蛋白（NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5）。結(jié)構蛋白主要參與病毒與宿主細胞的吸附及病毒顆粒的組裝；其中E蛋白是對病毒感染起保護性免疫作用的抗原。非結(jié)構蛋白則主要在病毒基因組的復制和翻譯過程中發(fā)揮重要作用[1]。登革病毒（

2、dengue virus，DEN）包括4個血清型（DENV-1型，DENV-2型，DENV-3型，DENV-4型），其引起的登革熱是世界上分布最廣、發(fā)病人數(shù)最多、危害最嚴重的蚊媒疾病，廣泛流行于全球100多個國家[2]。由其感染所引起的疾病包括：無癥狀感染、一般性發(fā)熱、溫和的登革熱（dengue fever，DF）以及嚴重的登革出血熱（dengue hemorrhagic fever， DHF）和登革休克綜合征（dengue shock

3、 syndrome，DSS）[3]。接種疫苗是控制登革熱最重要的手段。由于抗體依賴增強感染效應(Antibody-dependent enhancement,ADE)，理想的登革疫苗應該是能夠誘導人體產(chǎn)生4種血清型 DENV均有免疫保護作用[4-6]。
　　進展最快的登革疫苗是法國賽諾菲巴斯德公司的登革四價減毒活疫苗（ CYD-TDV），該疫苗已經(jīng)完成三期臨床試驗，于2016年1月份在墨西哥率先上市,臨床數(shù)據(jù)顯示，該疫苗抵抗DEN

4、V-1、DENV-3、DENV-4的有效率分別為50.3％、74.0%、77.7%，但抗DENV-2的有效率只有42.3%[7,8]。該嵌合疫苗是以黃病毒家族（YF-17D）毒株骨架，再以4個血清型DENV病毒的同源序列（prM-E）替換骨架病毒的相應基因得到的重組嵌合毒株，從而獲得合適的減毒效率和較強的免疫原性[9,10]。
　　我國研制的乙腦減毒活疫苗 SA14-14-2于1989年在中國被批準上市，目前為止，已經(jīng)有超過3億兒

5、童接種疫苗。研究顯示，該疫苗株具有良好的減毒特性和安全性，單次免疫能有效誘導產(chǎn)生保護性的中和抗體，而且免疫力持久[11-13]。由于黃病毒的基因機構、復制翻譯策略都非常相似，可以用分子生物學的方法相互改變黃病毒的基因，以構建新的嵌合病毒[14-16]。李曉峰等[17]將DENV2的PreM-E蛋白基因成功插入SA-14-14-2為骨架中，構建了ChinDENV2型嵌合疫苗，該嵌合病毒在小鼠和靈長類動物上具有減毒效果。本研究擬以乙腦減毒活

6、疫苗SA14-14-2為骨架，將登革4型病毒PreME蛋白編碼基因替換進SA14-14-2基因中，繼續(xù)構建DENV4型嵌合疫苗，初步完成乙腦/登革4型嵌合病毒的構建與生物學性質(zhì)評價。
　　本研究包括以下兩個部分：
　　一、乙腦/登革4型嵌合病毒的構建。
　　嵌合病毒是利用反向遺傳學的方法，由結(jié)構功能相似的同源或者異源病毒相互替換部分結(jié)構基因而獲得的一種新的病毒，為了保證重組病毒的安全性，我們一般采用已知特性的病毒株，一

7、般多選用減毒株作為病毒載體。本研究利用乙腦減毒活疫苗 SA14-14-2為骨架，我們采用分子生物學的方法將疫苗株的PrM和E蛋白編碼基因替換為登革4型病毒（DENV4-GZ30）的PrM和E蛋白的相應部分，構成一種新的嵌合質(zhì)粒，命名為pChinDENV4。
　　通過酶切圖譜初步確定嵌合質(zhì)粒的大小和完整性,進一步測定質(zhì)粒的全基因序列,運用 DNA STAR軟件比對嵌合質(zhì)粒與病毒基因序列的差異。利用體外轉(zhuǎn)錄的方法，將嵌合質(zhì)粒轉(zhuǎn)錄成RN

8、A，并且轉(zhuǎn)染BHK-21細胞，約3天后細胞出現(xiàn)典型病變后，得到嵌合病毒。通過反轉(zhuǎn)錄PCR實驗判斷病毒是否正確。測病毒cDNA序列，比對是否與原質(zhì)粒序列相同。
　　實驗結(jié)果表明，我們能通過反向遺傳學的方法成功拯救出乙腦/登革4型嵌合病毒。嵌合病毒能夠在BHK-21細胞上復制。
　　二、乙腦/登革4型嵌合病毒生物學特性評價。
　　我們對嵌合病毒與其親本病毒在不同細胞系中的生長特性進行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其與親本病毒株相比無顯著差

9、異。進一步對嵌合病毒的蝕斑特征及在動物體內(nèi)的神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力進行了測定，結(jié)果顯示嵌合病毒的蝕斑大小介于兩親本株之間，其神經(jīng)毒力和神經(jīng)侵襲力與親本株弱。
　　綜上，本研究采用反向遺傳學的方法，構建了一種新的登革乙腦嵌合病毒，通過將嵌合病毒與其親本病毒株生物學特性鑒定和比較，我們發(fā)現(xiàn)嵌合病毒在細胞上的復制生長能力沒有降低，但毒力較其親本病毒株減弱，乙型/登革病毒反向遺傳學系統(tǒng)的建立為基因乙腦疫苗株骨架的新型登革病毒四價疫苗的研制奠