HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制.pdf

1、前列腺癌是最常見的惡性腫瘤。在美國，前列腺癌是引起男性死亡率第二高的癌癥。前列腺癌發(fā)展緩慢，它是雄激素依賴性生長腫瘤。雄激素阻斷后，前列腺癌會出現(xiàn)消退。后來出現(xiàn)了激素抵抗型癌細(xì)胞株，可抵抗常規(guī)治療手段并最終導(dǎo)致死亡。因此，開展新型的治療方法來治療激素抵抗型前列腺癌尤為重要。研究表明，滅活仙臺病毒(Hemaglutinating virus of Japan Envelope，HVJ-E)不僅可以作為載體傳遞抗腫瘤藥物，激活多重抗腫瘤免疫

2、，同時還能直接殺傷腫瘤。本研究中，我們使用HVJ-E來誘導(dǎo)人前列腺癌細(xì)胞產(chǎn)生凋亡及自噬，并初步探討了其可能的作用機(jī)制。
　　首先，我們用HVJ-E處理PC3細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞出現(xiàn)生長停滯、皺縮和破裂的現(xiàn)象，F(xiàn)ACS檢測顯示，經(jīng)HVJ-E處理后，PC3細(xì)胞均產(chǎn)生明顯的凋亡，且呈劑量依賴關(guān)系，提示HVJ-E可直接導(dǎo)致PC3細(xì)胞凋亡。為探討HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，我們用Western Blot法檢測了Casp

3、ase信號通路的相關(guān)蛋白，結(jié)果表明，隨著HVJ-E濃度的升高，caspase-9、caspase-3、PARP均被有效激活。為進(jìn)一步驗證caspase通路在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用，我們以廣譜caspase抑制劑Z-VAD-FMK預(yù)處理細(xì)胞后再用HVJ-E處理，結(jié)果顯示，caspase-3的活化被顯著抑制，同時FACS檢測結(jié)果也表明，Z-VAD-FMK可顯著抑制HVJ-E誘導(dǎo)的凋亡率。
　　為進(jìn)一步探究HVJ-E致PC3

4、細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制，我們以Western Blot法檢測了MAPK信號通路中的3個主要亞族，結(jié)果表明p38、JNK和Erk1/2均被激活。為進(jìn)一步確認(rèn)MAPK通路在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用，我們分別利用p38抑制劑SB203580(10μM)、JNK抑制劑SP600125(7.5μM)、Erk1/2抑制劑U0126(20μM)預(yù)處理細(xì)胞30分鐘后，再以HVJ-E處理PC3細(xì)胞，Western Blot結(jié)果顯示，p38、JNK和

5、Erk1/2的激活均被顯著抑制。同時，F(xiàn)ACS和CCK-8的檢測結(jié)果也表明，各抑制劑可下調(diào)HVJ-E誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并減少HVJ-E導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，證實了MAPK在HVJ-E誘導(dǎo)的PC3細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。
　　為深入探明HVJ-E激活MAPK信號通路的可能機(jī)制，我們測定了HVJ-E處理PC3細(xì)胞后活性氧(ROS)的產(chǎn)生水平，結(jié)果顯示，隨著HVJ-E濃度的升高，PC3產(chǎn)生ROS的水平也升高，說明HVJ-E可刺激細(xì)胞產(chǎn)生ROS。

6、為研究ROS在HVJ-E激活MAPK通路中的作用，我們以活性氧清除劑(NAC)預(yù)處理PC3細(xì)胞30分鐘，然后加入HVJ-E作用24小時。再經(jīng)FACS法檢測細(xì)胞凋亡率，Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，NAC能抑制HVJ-E誘導(dǎo)的凋亡率;同時，NAC能抑制MAPK信號通路中JNK、Erk1/2、P38蛋白的磷酸化，提示ROS可能是HVJ-E激活MAPK信號通路，并最終導(dǎo)致PC3細(xì)胞凋亡的主要因素。
　　自噬在

7、細(xì)胞死亡中發(fā)揮重要作用，為研究HVJ-E是否可引起PC3細(xì)胞自噬，我們利用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染PC3細(xì)胞，觀察自噬小體，并通過LC3Ⅰ/Ⅱ的轉(zhuǎn)化計算，證實HVJ-E可誘導(dǎo)PC3細(xì)胞自噬。PI3K/Akt/mTOR/p70S6K通路對自噬為負(fù)調(diào)控，而Ⅲ型PI3K/becline-1則對自噬形成正調(diào)控，Western Blot結(jié)果顯示，經(jīng)HVJ-E處理后，AKT、mTOR、p70S6K被激活，同時Becline-1的表達(dá)也隨著HVJ-E的

8、處理而增強(qiáng)。由此說明PI3K/Becline-1參與了HVJ-E引起的細(xì)胞自噬。為進(jìn)一步研究自噬在HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡中的作用，我們分別利用自噬誘導(dǎo)劑Rapa和自噬抑制劑CQ分別預(yù)處理PC3細(xì)胞，然后再以HVJ-E進(jìn)行刺激，F(xiàn)ACS和CCK-8結(jié)果表明，RAPA可提高HVJ-E致PC3細(xì)胞的凋亡率(p＜0.01)，而CQ對HVJ-E致PC3細(xì)胞凋亡率沒有影響(p＞0.05);Western Blot檢測結(jié)果顯示，與HVJ-E組對照