神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子Semaphorin 3A在人頭頸鱗癌中的表達(dá)、作用及分子機(jī)制的研究.pdf

1、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌（Head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC，以下簡(jiǎn)稱(chēng)鱗癌）是最常見(jiàn)的頭頸部惡性腫瘤，具有較強(qiáng)的局部浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力，惡性程度往往較高。神經(jīng)軸突導(dǎo)向分子3A(Semaphorin3A，SEMA3A)是Semaphorin(SEMA)家族的成員。SEMA家族是一類(lèi)廣泛分布于神經(jīng)系統(tǒng)的蛋白，對(duì)神經(jīng)軸突的導(dǎo)向、成束、分支及突觸形成具有重要的調(diào)控作用。近來(lái)，大量研究證實(shí)SEMA3亞族的成

2、員能抑制多種惡性腫瘤的生長(zhǎng)，因此其具有重要的診療價(jià)值，且可作為一種潛在的治療靶點(diǎn)。目前尚未有確切的研究資料表明SEMA3A在人類(lèi)腫瘤包括頭頸癌中的表達(dá)及其作用。本研究擬探討SEMA3A在頭頸癌中的表達(dá)及其功能和相關(guān)的機(jī)制。
　　目的:
　　1、觀(guān)察SEMA3A在人頭頸鱗癌標(biāo)本中的表達(dá)，評(píng)價(jià)SEMA3A的表達(dá)水平與頭頸鱗癌臨床病理以及預(yù)后的關(guān)系;
　　2、觀(guān)察SEMA3A對(duì)頭頸鱗癌移植瘤生長(zhǎng)的影響;
　　3、明確S

3、EMA3A對(duì)頭頸鱗癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響;
　　4、初步探討SEMA3A對(duì)頭頸鱗癌作用的分子生物學(xué)機(jī)制。
　　方法:
　　1、應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)100例人頭頸鱗癌標(biāo)本及20例正常頭頸粘膜組織標(biāo)本中SEMA3A的表達(dá)高低;統(tǒng)計(jì)分析SEMA3A表達(dá)水平與腫瘤臨床病理以及預(yù)后的關(guān)系。
　　2、構(gòu)建HNSCC的裸鼠移植瘤動(dòng)物模型，利用能夠過(guò)表達(dá)SEMA3A的腺病毒pAdCMV-SEMA3A-MCS-EGFP及

4、空載病毒pAdCMV-MCS-EGFP分次多點(diǎn)注射于移植瘤瘤內(nèi)及瘤周，觀(guān)察SEMA3A過(guò)表達(dá)后腫瘤生長(zhǎng)的大小變化。
　　3、將pAdCMV-SEMA3A-MC S-EGFP腺病毒及pAdCMV-MCS-EGFP空載病毒感染HNSCC細(xì)胞系，獲得瞬時(shí)高表達(dá)SEMA3A的細(xì)胞株（實(shí)驗(yàn)組）及相對(duì)低表達(dá)SEMA3A的細(xì)胞株（對(duì)照組）;同時(shí)利用siRNA抑制HNSCC細(xì)胞中SEMA3A的表達(dá)，觀(guān)察病毒感染及siRNA抑制使SEMA3A表達(dá)改

5、變后細(xì)胞表型的變化;應(yīng)用RT-qRCR、Western blot方法分別檢測(cè)兩組細(xì)胞中SEMA3A以及上皮和間充質(zhì)標(biāo)志物基因水平和蛋白水平的表達(dá)變化;應(yīng)用RT-qRCR、Westernblot、CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)、TUNEL染色等方法分析SEMA3A對(duì)HNSCC細(xì)胞及移植瘤組織的增殖、侵襲、凋亡、細(xì)胞周期等相關(guān)分子生物學(xué)作用的影響。
　　4、應(yīng)用RT-qRCR、Western blot等實(shí)驗(yàn)方法，研究SEMA3A在HNSCC

6、細(xì)胞及組織中發(fā)揮抑癌作用的潛在機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1、免疫組織化學(xué)染色結(jié)果顯示:20例正常組織中18例檢測(cè)出SEMA3A高表達(dá)，而100例頭頸鱗狀細(xì)胞癌標(biāo)本中只有43例檢測(cè)出SEMA3A高表達(dá)，表明SEMA3A在腫瘤組織中呈現(xiàn)低表達(dá)(p＜0.001); SEMA3A的表達(dá)與頭頸鱗癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期密切相關(guān)(p＜0.05);生存分析表明SEMA3A高表達(dá)組患者總體生存率明顯高于低表達(dá)組患者(p＜0.05)。

7、
　　2、通過(guò)構(gòu)建HNSCC裸鼠移植瘤模型發(fā)現(xiàn)，多次多點(diǎn)注射SEMA3A腺病毒于移植瘤瘤內(nèi)及瘤周，能夠明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)且誘導(dǎo)組織的凋亡。
　　3、SEMA3A的高表達(dá)明顯抑制了HNSCC細(xì)胞的上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT，epithelial-mesenchymal transition)進(jìn)程，表現(xiàn)為細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變，上皮標(biāo)志物E-cadherin和β-catenin表達(dá)升高，間充質(zhì)標(biāo)志物Vimentin和N-cadherin

8、表達(dá)下降。細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖能力顯著降低，且細(xì)胞周期受到抑制，同時(shí)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象顯著。
　　4、通過(guò)腺病毒感染使SEMA3A過(guò)表達(dá)后，NF-κB通路、SNAI2明顯受抑制，Caspase-5和Caspase-7明顯被激活;而通過(guò)siRNA抑制SEMA3A后，NF-κB通路、SNAI2被激活，Caspase-5和Caspase-7隨即受抑制，提示SEMA3A可能通過(guò)NF-κB和SNAI2抑制遷移、侵襲和EMT進(jìn)程，通過(guò)Caspas

9、e通路介導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。
　　結(jié)論:
　　本實(shí)驗(yàn)證實(shí)SEMA3A在人頭頸鱗狀細(xì)胞癌組織中呈低表達(dá)，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、病理分級(jí)、臨床分期及患者的生存率密切相關(guān)，提示SEMA3A的異常表達(dá)可能與頭頸鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，并且可作為一種新的生物學(xué)標(biāo)志物用于患者的診斷和預(yù)后的預(yù)測(cè)。其次，SEMA3A能通過(guò)降低細(xì)胞的增殖能力、促進(jìn)凋亡來(lái)抑制頭頸癌腫瘤的生長(zhǎng)，可能通過(guò)抑制NF-κB、SNAI2信號(hào)通路來(lái)抑制頭頸鱗癌細(xì)胞發(fā)生EMT，降低其遷