細胞自噬在OVA和HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及機制.pdf

1、支氣管哮喘（簡稱哮喘），是最常見的氣道慢性炎癥性疾病之一，嚴重威脅著人類的健康。目前全世界約有3億哮喘患者，其中中國有3千萬左右，雖然發(fā)病率不高，但是病死率卻居高不下。哮喘是以嗜酸性粒細胞，肥大細胞，T淋巴細胞等氣道局部浸潤為主，主要表現(xiàn)為氣道高反應(yīng)性，粘液高分泌和可逆性的氣流受限。傳統(tǒng)的變態(tài)反應(yīng)型哮喘氣道炎癥主要表現(xiàn)為2型輔助性T(Th)細胞、嗜酸性粒細胞和激活的肥大細胞的增多以及Th2型細胞因子（IL-4、IL-5和IL-13等）的

2、大量分泌。近年來一些研究表明一些新的細胞類型如TH17細胞，Treg細胞，DC細胞等，新型的細胞因子如IL-25，IL-33，TSLP在哮喘氣道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中也發(fā)揮著關(guān)鍵的調(diào)控作用，然而哮喘發(fā)病的分子學(xué)機制至今仍未完全闡明。
　　細胞自噬是機體一種重要的保護和防御機制，在機體維持內(nèi)穩(wěn)態(tài)和適應(yīng)微環(huán)境改變的過程中發(fā)揮著非常重要的作用。在某些特定的環(huán)境（如饑餓，生長因子缺乏，缺氧）下，細胞內(nèi)可以形成一種雙層膜的囊泡結(jié)構(gòu)，該囊泡結(jié)構(gòu)

3、可以捕獲細胞內(nèi)受損的細胞器（如線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體等）和變性的蛋白質(zhì)，形成細胞自噬體，然后細胞自噬體可以與細胞內(nèi)的溶酶體結(jié)合成自噬溶酶體，進而在溶酶體內(nèi)各種水解酶的作用下，將其內(nèi)的細胞器和生物大分子消化降解，從而為新的生物大分子合成提供原料和能量。細胞自噬過程（包括細胞自噬體的形成，細胞自噬體捕獲受損的細胞器和生物大分子的過程）受多種分子調(diào)控，這些分子統(tǒng)稱為Atg(autophagy-related)家族。其中Beclin-1（又稱

4、為Atg6）在細胞自噬體形成過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，而LC3B（Atg8的同源蛋白）則在細胞自噬體捕獲受損細胞器和生物大分子的過程中非常重要，脂質(zhì)化的LC3BⅡ與LC3B本體LC3BⅠ的比例已經(jīng)被公認為是WesternBlot檢測細胞自噬的金標準。除此之外，目前已發(fā)現(xiàn)30種以上的Atg基因和蛋白與細胞自噬的分子機制有關(guān)。
　　雖然細胞自噬有利于維持機體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，但是，在特定的情況下，細胞內(nèi)大量細胞器和生物大分子的消耗會導(dǎo)致其死亡

5、，稱之為細胞自噬死亡。所以在不同的情況下，細胞自噬可以保護細胞，也可以促進細胞死亡，因此在不同疾病的發(fā)病過程中細胞自噬發(fā)揮著不同的作用。目前越來越多的研究證明細胞自噬在多種呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病過程中有重要的調(diào)控作用，如慢性阻塞性肺疾病(COPD)，肺動脈高壓，急性肺損傷，囊性纖維病等，然而，關(guān)于細胞自噬在支氣管哮喘發(fā)病過程中的作用卻鮮有研究報導(dǎo)。
　　本實驗分兩部分進行研究:(1)利用細胞自噬相關(guān)基因敲除小鼠LC3B-/-構(gòu)建OVA

6、誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥模型闡明細胞自噬在OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及其機制;(2)利用細胞自噬相關(guān)基因敲除小鼠LC3B-/-構(gòu)建HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥模型闡明細胞自噬在HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用，并通過骨髓移植技術(shù)探究細胞自噬在HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的作用機制。
　　第一部分細胞自噬在OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及機制
　　目的:研究細胞自噬在OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用及其機制。

7、>　　方法:健康的雄性C57BL/6小鼠，相同周齡的雄性LC3B-/-小鼠，分別隨機分為生理鹽水對照組（WT/NS和LC3B/NS）和哮喘模型組（WT/OVA和LC3B/OVA）。哮喘模型組以卵白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)建立哮喘模型生理鹽水對照組則以同等劑量的生理鹽水代替OVA，于最后一次OVA激發(fā)后24小時后處理小鼠，檢測其肺泡灌洗液內(nèi)炎癥細胞的總數(shù)，嗜酸性粒細胞比例及絕對值，肺組織HE染色觀察氣道炎癥浸潤的情況，PAS染色觀察粘液的

8、分泌情況，肺組織mRNA檢測一些炎癥因子的表達，ELISA檢測肺泡灌洗液內(nèi)炎癥因子的分泌。體外利用IL-13干預(yù)人肺上皮細胞BEASE-2B，Q-PCR檢測IL-25分泌的變化，。OVA干預(yù)人氣道上皮細胞HBE，Western Blot檢測LC3B表達的變化。
　　結(jié)果:LC3B敲除后明顯緩解OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥，肺泡灌洗液中炎癥細胞總數(shù)，嗜酸性粒細胞比例和絕對值都明顯減少，肺部炎癥浸潤明顯緩解，粘液分泌明顯下調(diào)，肺泡灌洗液中

9、炎癥因子的分泌，肺組織炎癥因子的表達也明顯下降。體外IL-13干預(yù)人氣道上皮細胞BEASE-2B均能誘導(dǎo)IL-25表達的增加，然而敲除自噬相關(guān)基因之后IL-25的表達則會明顯下調(diào)。且OVA干預(yù)人氣道上皮細胞HBE可以明顯誘導(dǎo)LC3B表達的增加。
　　結(jié)論:細胞自噬相關(guān)基因LC3B敲除可以緩解OVA誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥，可能是通過抑制IL-25，IL-33等炎癥因子的分泌從而減輕氣道上皮細胞損傷實現(xiàn)的。
　　第二部分細胞自噬在H

10、DM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用
　　目的:研究細胞自噬在OVA誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥中的調(diào)控作用。
　　方法:健康的雄性C57BL/6小鼠，相同周齡的雄性LC3B-/-小鼠，分別隨機分為生理鹽水對照組（WT/NS和LC3B/NS）和哮喘模型組（WT/HDM和LC3B/HDM）。哮喘模型組以氣道滴注塵螨提取物(HDM)致敏和激發(fā)建立哮喘模型，生理鹽水對照組則以同等劑量的生理鹽水代替HDM。于最后一次HDM激發(fā)后48小時后處理小

11、鼠，檢測其肺泡灌洗液內(nèi)炎癥細胞的總數(shù)，嗜酸性粒細胞比例及絕對值，肺組織mRNA檢測一些炎癥因子的表達，ELISA檢測肺泡灌洗液內(nèi)炎癥因子的分泌。建立骨髓移植模型，將LC3B-/-骨髓移植到WT小鼠體內(nèi)，觀察骨髓內(nèi)敲除LC3B對哮喘表型是否有影響。然后將WT骨髓回輸?shù)絃C3B-/-小鼠體內(nèi)，觀察對于 LC3B-/-小鼠的哮喘表型是否有一定的“挽救”作用。
　　結(jié)果:LC3B敲除后明顯緩解HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥，肺泡灌洗液中炎癥細胞

12、總數(shù)，嗜酸性粒細胞比例和絕對值都明顯減少，肺泡灌洗液中炎癥因子的分泌，肺組織炎癥因子的表達也明顯下降。將LC3B-/-小鼠骨髓移植到WT小鼠體內(nèi)（相當于骨髓特異性敲除LC3B），對HDM誘導(dǎo)的哮喘氣道炎癥有一定的緩解作用;然而將WT-小鼠骨髓移植到LC3B-/-小鼠體內(nèi)，對于LC3B-/-小鼠的表型并沒有明顯的“挽救”作用。
　　結(jié)論:細胞自噬相關(guān)基因LC3B敲除可以緩解HDM誘導(dǎo)的小鼠氣道炎癥，其調(diào)控作用主要在氣道上皮細胞層面，