人溶菌酶基因在昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)及其表達(dá)產(chǎn)物活性檢測(cè).pdf

1、人溶菌酶(human lysozyme，hlyz)是一種堿性球蛋白，由130個(gè)氨基酸組成，分子量為14.7KD。它是一種有效的抗菌劑，全稱為1，4.β-N溶菌酶，又稱粘肽N-乙?；邗Ｋ饷?。它做為一種無殘留、無耐藥性的新型抗菌藥物，代表著未來抗菌藥物應(yīng)用和發(fā)展方向。 本研究擴(kuò)增攜帶重組pGEM-hlyz質(zhì)粒陽性工程菌，用限制性核酸內(nèi)切酶Xhol分別酶切處理pGEM-hlyz重組質(zhì)粒和桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacl，將目

2、的片段進(jìn)行電泳、膠回收和連接。將連接子轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆菌株，提取質(zhì)粒，并以Xhol和pstl酶切鑒定hlyz插入pFastBacI的方向，將正向插入的連接子，命名為pFastbacI-hlyZ。 將pFastBacI-hlyz重組質(zhì)粒按Bac-to-Bac表達(dá)系統(tǒng)操作步驟轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，純化培養(yǎng)三代，挑取白色菌落提取基因組DNA，并hlyz特異引物和M13通用引物對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，陽性

3、質(zhì)粒常規(guī)方法轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，收取顯著病變的細(xì)胞，即P1代病毒，命名為rBac-hlyz，同時(shí)以野生桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞作為陰性對(duì)照。感染96～120h后，用免疫熒光技術(shù)(IFA)方法對(duì)P3代重組桿狀病毒rbac-hlyz感染Sf9細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，觀察到特異性的熒光，而陰性對(duì)照則無。用SDS-PAGE及Westem Blot方法對(duì)P3代重組桿狀病毒rbac-hlyz感染Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行檢測(cè)，觀察發(fā)現(xiàn)有符合預(yù)測(cè)大小的14.7KD蛋白質(zhì)

4、條帶，陰性對(duì)照則此無特異條帶。通過以上兩個(gè)試驗(yàn)，表明我們獲得了重組人溶菌酶蛋白。 用溶壁微球菌制備含有微球菌的瓊脂平板，進(jìn)行瓊脂平板擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)重組人溶菌酶蛋白的活性。結(jié)果顯示P4代rbac-hlyz重組毒感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清孔內(nèi)得到了約20mm抑菌圈，細(xì)胞裂解上清孔得到了約11mm的抑菌圈，標(biāo)準(zhǔn)蛋清溶菌酶溶液孔內(nèi)得到了約12mm的抑菌圈。陰性對(duì)照孔內(nèi)無抑菌現(xiàn)象。 針對(duì)臨床上常見金黃色葡萄球菌大腸桿菌，我們應(yīng)用瓊

5、脂平板擴(kuò)散試驗(yàn)檢測(cè)thlyz對(duì)二者的溶菌活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)于金黃色葡萄球菌，P4代rbac-hlyz重組毒感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清孔內(nèi)得到了約15mm的抑菌圈，細(xì)胞裂解上清孔得到了約llmm的抑菌圈，標(biāo)準(zhǔn)蛋清溶菌酶溶液孔內(nèi)得到了約8mm的抑菌圈。而陰性對(duì)照孔內(nèi)沒有抑菌現(xiàn)象。而對(duì)于大腸桿菌，標(biāo)準(zhǔn)蛋清溶菌酶得到了大約9mm的抑菌圈，而P4代rbac-hlyz重組毒感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)上清孔內(nèi)得到了約只有2mm的抑菌圈。表明本研究重組表達(dá)所獲