神經(jīng)生長因子對上皮性卵巢癌細胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)機制研究.pdf

1、卵巢癌是致死率最高的婦科惡性腫瘤，發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，嚴重危害女性的生命健康。卵巢癌是高度異質(zhì)性腫瘤，組織學(xué)亞型較多，不同類型的卵巢癌在形態(tài)特征、臨床表現(xiàn)、遺傳改變、腫瘤行為等方面均表現(xiàn)出一定的差異，且難以在早期發(fā)現(xiàn)，易發(fā)生轉(zhuǎn)移、化療耐藥、復(fù)發(fā)，使卵巢癌的診斷和治療都面臨著極大的挑戰(zhàn)。卵巢癌的致病機理十分復(fù)雜，至今仍未完全闡明。一般的觀點認為卵巢癌的發(fā)生既與卵巢特殊的解剖結(jié)構(gòu)、機械刺激等有關(guān)，也與卵巢微環(huán)境中生長因子、黏附

2、因子、免疫炎性反應(yīng)因子等的功能失調(diào)而導(dǎo)致細胞內(nèi)信號分子發(fā)生異位、突變、丟失、結(jié)構(gòu)重排等使細胞的正常生長、增殖、分化、凋亡失控而引起細胞惡性轉(zhuǎn)化相連。神經(jīng)生長因子（NGF）是一種多效性的肽類激素，通過與靶細胞表面的高親和力受體TrkA和低親和力受體P75結(jié)合來調(diào)控細胞的存活、生長、分化、凋亡等生理活動，對機體正常生理狀態(tài)和病理發(fā)展有重要的影響。近年來的大量研究發(fā)現(xiàn)：NGF及受體（NGFRs）在乳腺癌、前列腺癌、成神經(jīng)細胞瘤等惡性腫瘤中廣泛

3、表達，異常表達的NGF/NGFRs影響腫瘤的發(fā)生、生長、增殖、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等過程。NGF/NGFRs在正常卵巢組織中低表達，能調(diào)節(jié)垂體分泌卵泡刺激素（FSH）及卵巢上皮表面FSH受體水平、卵泡發(fā)育、排卵等卵巢正常生理功能，異常表達的NGF/NGFRs會引起卵泡刺激素分泌紊亂，導(dǎo)致上皮性卵巢癌的啟動和發(fā)生。但NGF/NGFRs參與卵巢癌的啟動、發(fā)生、發(fā)展及作用機理等方面的知識了解甚少，作用機制尚未完全闡明。因此，深入了解NGF/

4、NGFRs對卵巢癌細胞生物學(xué)行為的影響及相關(guān)分子機制，對卵巢癌的預(yù)防、診斷、治療、預(yù)后等有重要意義。本文的主要研究內(nèi)容包括：
　?、倏疾霳GF/NGFRs在卵巢癌細胞系中的表達。采用定量RT-PCR和Western blot法檢測常規(guī)培養(yǎng)（含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基）條件下NGF/NGFRs在卵巢癌細胞系A(chǔ)2780、SKOV3、OVCAR3、CAOV3中的表達情況。結(jié)果顯示：NGF/NGFRs均同時在這幾種卵巢癌細胞中表達，內(nèi)源

5、性的NGF在OVCAR3、CAOV3細胞中表達水平較高，為后續(xù)實驗奠定了細胞學(xué)基礎(chǔ)。
　　②考察NGF/NGFRs對卵巢癌細胞存活、生長、增殖、細胞周期、生長節(jié)律、凋亡的影響。采用細胞行為學(xué)觀察實驗、定量RT-PCR、Western blot等方法檢測NGF/NGFRs對卵巢癌細胞存活、生長、增殖、細胞周期、生長節(jié)律、凋亡相關(guān)基因和蛋白表達的影響。通過特異性的NGF/NGFRs抑制劑阻斷NGF/NGFRs的作用，考察NGF/NGF

6、Rs在卵巢癌細胞存活、生長、增殖、細胞周期、生長節(jié)律、凋亡中的作用。結(jié)果顯示：NGF下調(diào)CAOV3和OVCAR3細胞中SIRT1（Sirtuin1）、Survivin的表達水平，減弱卵巢癌細胞的存活能力；NGF上調(diào)CAOV3和OVCAR3細胞中Ki67、PPARδ，下調(diào)PCNA的表達水平，抑制卵巢癌細胞的增殖能力；NGF上調(diào)CAOV3和OVCAR3細胞中Cyclin E1、P21，下調(diào)Cyclin D1的表達水平，影響卵巢癌的周期調(diào)控，

7、促進卵巢癌細胞的凋亡；NGF下調(diào)CAOV3和OVCAR3細胞中Clock、FBXL3的表達水平，影響卵巢癌細胞的生長節(jié)律，但具體的生物學(xué)效應(yīng)還需要進一步深入研究；NGF上調(diào)CAOV3和OVCAR3細胞中P53、BCL2、Caspase9，下調(diào)Caspase3、Caspase7的表達水平，上調(diào)CAOV3細胞中CYCS的表達而下調(diào)OVCAR3細胞中的CYCS，下調(diào)CAOV3細胞中BAX的表達而上調(diào)OVCAR3細胞中的BAX，影響卵巢癌細胞的

8、凋亡過程。
　?、劭疾霳GF/NGFRs對卵巢癌細胞粘附能力的影響。采用細胞粘附實驗、定量RT-PCR、Western blot等方法檢測NGF/NGFRs對卵巢癌細胞粘附能力、緊密連接相關(guān)基因mRNA和蛋白表達的影響。結(jié)果顯示：NGF上調(diào)CAOV3和OVCAR3細胞中緊密連接蛋白CLDN3、CLDN4的表達水平，下調(diào)CAOV3細胞中緊密連接蛋白CLDN1的表達而上調(diào)OVCAR3細胞中的表達水平，影響卵巢癌細胞間的連接狀態(tài)， NG

9、F/NGFRs的抑制劑能阻斷這種作用。結(jié)果表明：NGF/NGFRs能通過調(diào)節(jié)卵巢癌細胞間的緊密連接狀態(tài)而參與卵巢癌細胞成團、運動能力的調(diào)節(jié)。
　　④考察NGF/NGFRs對卵巢癌細胞遷移能力的影響及分子機制。利用Transwell小室及本實驗室自行構(gòu)建的微流控芯片考察NGF對卵巢癌細胞遷移行為的影響；通過定量RT-PCR、Western blot法檢測NGF對WNT/β-catenin信號通路中的關(guān)鍵因子β-catenin及下游靶

10、基因CD44、C-myc、MMP2、MMP7、TIMP2等表達的影響，考察NGF影響卵巢癌細胞遷移能力變化的分子機制。結(jié)果顯示：不管是在二維培養(yǎng)還是三維培養(yǎng)條件下，NGF均能影響CAOV3和OVCAR3的遷移能力；NGF對經(jīng)典WNT/β-catenin信號中的關(guān)鍵分子及下游靶基因的表達有影響，NGF可通過激活或調(diào)控WNT/β-catenin信號通路影響卵巢癌細胞的遷移。NGF對不同卵巢癌細胞遷移變化的影響有一定的差異性，說明NGF對卵巢

11、癌細胞的生物學(xué)效應(yīng)有細胞特異性。
　　綜上所述，得出以下結(jié)論：NGF/NGFRs在選擇的這幾種上皮性卵巢癌細胞系中均表達；NGF能調(diào)節(jié)卵巢癌細胞的存活、生長、凋亡相關(guān)基因的表達水平，影響卵巢細胞的周期和生長節(jié)律；NGF能調(diào)節(jié)卵巢癌細胞中緊密連接蛋白CLDN1、CLDN3、CLDN4的表達，影響卵巢癌細胞之間的連接狀態(tài)，參與卵巢癌細胞的轉(zhuǎn)移過程；NGF可通過經(jīng)典的WNT/β-catenin信號通路介導(dǎo)卵巢癌細胞的遷移行為。以上實驗結(jié)