NID1通過EMT促進卵巢癌侵襲轉移的分子機制研究.pdf

1、卵巢癌是惡性程度最高的婦科腫瘤，缺乏早期診斷標志物、容易早期轉移擴散以及耐受化療藥物是造成卵巢癌死亡-發(fā)病率（death-incidence ratio）高的重要因素。深入研究卵巢癌發(fā)生發(fā)展尤其是侵襲轉移的分子機制，并由此制定有效的分子診斷方法與靶向治療策略，對于提高卵巢癌的診治水平并降低死亡率具有重要的理論和現(xiàn)實意義。NID1（Nidogen-1）是我們在前期卵巢癌蛋白質組研究中篩選并驗證的可輔助卵巢癌診斷的候選血漿蛋白標志物之一，它

2、在卵巢癌患者血漿中的蛋白水平顯著升高，與其它候選蛋白進行聯(lián)合檢測可進一步提高診斷靈敏性和特異性。另外，NID1在攜帶淋巴結轉移的卵巢癌患者血漿和腫瘤組織中的水平均高于無淋巴結轉移的卵巢癌患者。NID1作為細胞外基質特化結構——基膜的重要成分，它在卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用并不清楚。結合文獻調研（“腫瘤侵襲、EMT和基膜三者存在密切關聯(lián)”）和前期臨床數(shù)據(jù)（“卵巢癌樣本中NID1的高表達與淋巴結轉移相關”），我們推測NID1極可能在卵巢癌的侵襲

3、轉移過程中發(fā)揮重要作用。以此為據(jù)，本課題從以下四方面深入開展NID1對卵巢癌細胞侵襲轉移的影響及其分子機制的研究，以期為NID1作為候選的卵巢癌預后標志物和治療靶標的研究價值提供科學依據(jù)。
　?。?）穩(wěn)定過表達NID1蛋白和瞬時敲降NID1蛋白的細胞模型的建立：采用NID1表達質粒轉染OVCAR-3細胞并篩選穩(wěn)定的單克隆細胞株（命名為OVCAR-3-NID1-MC細胞），采用兩種NID1-siRNA分別瞬時轉染HEY細胞獲得HEY

4、-NID1-si798細胞和HEY-NID1-si2983細胞。進一步采用熒光定量RT-PCR和Western blot鑒定這些細胞模型，確認OVCAR-3-NID1-MC細胞是穩(wěn)定高表達NID1蛋白的細胞模型，而HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983細胞是瞬時敲降NID1蛋白的細胞模型。
　　（2）NID1對卵巢癌細胞侵襲轉移能力的影響：劃痕實驗顯示OVCAR-3-NID1-MC細胞的側向遷移速度明顯快于對

5、照細胞，Transwell侵襲轉移實驗顯示OVCAR-3-NID1-MC細胞的轉移能力和侵襲能力明顯優(yōu)于OVCAR-3-vector，表明過表達NID1增強卵巢癌細胞OVCAR-3的遷移和侵襲能力。同樣地，Transwell侵襲轉移實驗顯示，HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983細胞的轉移能力和侵襲能力弱于對照細胞，表明敲降NID1減弱卵巢癌細胞HEY遷移和侵襲能力。
　?。?）NID1對卵巢癌細胞 EMT相

6、關表型的影響：不同于對照細胞的“立方形”外形，OVCAR-3-NID1-MC細胞呈現(xiàn)出“梭形”外形。熒光定量RT-PCR和Western blot結果顯示OVCAR-3-NID1-MC細胞的上皮細胞標志分子E-cadherin表達下降，間質細胞標志分子（包括Vimentin和N-cadherin）和EMT相關轉錄因子Twist-2表達表達升高。細胞免疫熒光的再次證實了OVCAR-3-NID1-MC細胞中Vimentin熒光信號更強。與之

7、相對應，HEY-NID1-si798和HEY-NID1-si2983細胞與對照細胞的“梭形”相比更偏“立方形”外形，盡管 Vimentin、N-cadherin和Twist-2并沒有發(fā)生預料中的改變，但Western blot和細胞免疫熒光結果均顯示兩種瞬時敲降NID1的HEY細胞的E-cadherin表達都顯著升高。以上結果表明，NID1促進卵巢癌細胞發(fā)生EMT。
　　（4）NID1通過 ERK/MAPK通路改變EMT相關分子表

8、達：Western blot結果顯示，OVCAR-3-NID1-MC細胞中ERK1/2的磷酸化水平顯著高于對照細胞。經ERK/MAPK通路的抑制劑U0126下調其ERK1/2的磷酸化水平后，E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和Twist-2表達水平出現(xiàn)逆轉。以上結果提示，NID1可通過ERK/MAPK通路改變卵巢癌細胞EMT相關分子的表達，促進細胞發(fā)生EMT。另外，Western blot結果顯示OVCAR-3

9、-NID1-MC細胞中粘著斑激酶FAK磷酸化水平（磷酸化位點為397位酪氨酸）水平升高，表明FAK處于活化狀態(tài)，推測FAK可能是ERK/MAPK通路的上游調控蛋白。
　　綜上所述，本研究利用穩(wěn)定過表達NID1蛋白和瞬時敲降NID1蛋白的細胞模型，首先發(fā)現(xiàn)NID1促進卵巢癌細胞的侵襲和轉移，并同時伴隨著EMT發(fā)生，從而證實了“NID1通過EMT促進卵巢癌侵襲轉移”這一學術猜想。然后，在穩(wěn)定過表達NID1蛋白的細胞模型中，發(fā)現(xiàn)ERK/