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1、研究背景:Urofacial(Ochoa)綜合征(UFS)是一種罕見(jiàn)的常染色體隱性遺傳病。通過(guò)家系連鎖分析及染色體外顯子測(cè)序,HPSE2缺陷被證明是UFS的致病基因,但其機(jī)制還不完全清楚,對(duì)該基因的功能也多局限于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)。
目的:利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè),HPSE2為分泌型蛋白可能性大,其N端38個(gè)氨基酸為分泌信號(hào)肽。本研究以EGFP為表達(dá)及鑒定標(biāo)簽,驗(yàn)證HPSE2基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)是否為分泌表達(dá)。
方法:利用重組
2、PCR技術(shù),在EGFP基因5′端加入包含有HPSE2分泌信號(hào)肽的CDS區(qū)(1~588bp),構(gòu)建為HPSE2-EGFP-partial融合基因;構(gòu)建5′端融合IgGκ分泌信號(hào)肽的EGFP融合基因IgGκ-EGFP,將兩種融合基因克隆到哺乳動(dòng)物表達(dá)載體pcDNA3.1(+)上,構(gòu)建成pcDNA3.1(+)-HPSE2–EGFP-partial和pcDNA3.1(+)-IgGκ-EGFP表達(dá)質(zhì)粒。以pEGFP-C3作為胞漿表達(dá)對(duì)照,pcDN
3、A3.1(+)-IgGκ-EGFP作為分泌表達(dá)對(duì)照,pEGFP-N1-HPSE2為陽(yáng)性對(duì)照,并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染人胚腎Hek293T細(xì)胞,通過(guò)熒光顯微鏡及Western檢測(cè)重組基因表達(dá)產(chǎn)物在細(xì)胞內(nèi)外的分布。
結(jié)果:經(jīng)酶切、PCR及測(cè)序鑒定,重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-HPSE2-EGFP-partial和pcDNA3.1(+)-IgGκ-EGFP構(gòu)建成功,經(jīng)熒光顯微鏡及Westernblot檢測(cè),證實(shí)HPSE2基因的表達(dá)產(chǎn)
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