枯草芽孢桿菌rbsk基因和tkt基因的敲除對(duì)核黃素發(fā)酵的影響.pdf

1、本課題的研究內(nèi)容是通過在枯草芽孢桿菌中敲除rbsK基因,減少核黃素生產(chǎn)途徑的副產(chǎn)物,進(jìn)而考查對(duì)核黃素產(chǎn)量的影響。同時(shí),敲除tkt基因即構(gòu)建轉(zhuǎn)酮酶缺陷菌株,使rbsK的敲除不至于引起其他副產(chǎn)物支路通量的增加,影響發(fā)酵結(jié)果。
　　 rbsK基因在戊糖磷酸途徑中表達(dá)核糖激酶,進(jìn)一步催化D-核糖的生成。該基因的敲除理論上將造成D-核糖-5磷酸的積累。由于核黃素的生成需要兩種直接前體物,其合成方程式為2DHPB+DARPP=Ribofla

2、vin,這兩種前體物分別由核黃素生產(chǎn)的長途徑和短途徑提供,而D-核糖-5磷酸又是這兩條途徑必需的前體物。同時(shí),為避免由于D-核糖生成支路的切斷引起另一個(gè)方向酮糖生成支路通量的增大,減少不必要的副產(chǎn)物的生成,本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案敲除tkt基因。以rbsK基因的敲除為例:經(jīng)PCR擴(kuò)增得到的rbsK基因片段進(jìn)行酶切,再與以同樣內(nèi)切酶切后的載體質(zhì)粒pUC18在大腸桿菌中進(jìn)行酶連,得到第一個(gè)重組質(zhì)粒pUC18-rbsK;在pUC18-rbsK質(zhì)粒的rb

3、sK片段上選擇合適的酶切位點(diǎn)進(jìn)行酶切,再與同樣酶切后的抗性基因(Spc、Kan抗性等)進(jìn)行酶連,得到第二個(gè)重組質(zhì)粒pUC18-rbsK-Spc或pUC18-rbsK-Kan,使rbsK基因不能完整表達(dá)而失活；構(gòu)建成功的整合型敲除質(zhì)粒pUC18-rbsK-Spc或pUC18-rbsK-Kan在枯草芽孢桿菌中雙交換整合,利用插入的抗性基因?qū)赀M(jìn)行抗性篩選,最終實(shí)現(xiàn)了在枯草芽孢桿菌中敲除rbsK基因的目的。同理,經(jīng)一系列酶切、酶連、轉(zhuǎn)化、篩

4、選等操作后,在枯草芽孢桿菌中可實(shí)現(xiàn)tkt基因的敲除。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要在核黃素生產(chǎn)菌株RH33、RH44中敲除rbsK基因和tkt基因,基因操作完成后,對(duì)新構(gòu)建的工程菌與出發(fā)菌株進(jìn)行考察對(duì)比。首先利用LC-MS手段檢測(cè)基因敲出前后菌株的相關(guān)代謝物,即D-核糖,一系列酮糖等的相對(duì)變化,結(jié)果顯示,兩個(gè)基因缺陷的菌株不再合成D-核糖,相關(guān)酮糖(以7磷酸-景天庚酮糖為檢測(cè)目標(biāo))的產(chǎn)生量也有了較大程度的降低；搖瓶發(fā)酵后,發(fā)現(xiàn)兩個(gè)基因的敲除