應用噬菌體展示肽技術篩選塵螨變應原B細胞表位模擬肽及其體內外生物學功能的研究.pdf

1、塵螨是引起變應性疾病的主要變應原，用塵螨變應原提取物進行臨床檢測和特異性免疫治療應用廣泛。然而塵螨提取物受原材料和提取技術等因素的影響，在蛋白成分、含量及純度等方面差異性大，直接影響了臨床診斷的準確性以及特異性免疫治療的療效和安全性。
　　本研究中，我們拋開對變應原本身的研究，用塵螨變應原陽性患者血清中針對塵螨的特異性IgE抗體為釣餌，進行由果到因的反推。通過噬菌體展示隨機肽技術進行陰陽雙重篩選，得出與塵螨特異性IgE結合的模擬肽

2、。首先用塵螨變應原IgE陰性的過敏患者血清中IgE進行陰性篩選排除IgE保守的重鏈結合肽，再用塵螨陽性患者血清中IgE為釣餌，得到和IgE抗體高變區(qū)結合的塵螨B細胞線性以及構象表位模擬肽庫。為了驗證篩選的塵螨B細胞表位模擬肽的體內生物學功能，我們利用戶塵螨誘發(fā)的變應性鼻炎伴支氣管哮喘小鼠模型，觀察所篩選的塵螨B細胞表位模擬肽1，2與3對小鼠模型氣道炎癥的治療作用，為進一步研制和開發(fā)塵螨特異性免疫治療的B細胞表位疫苗提供實驗依據(jù)。

3、　　一、與塵螨IgE結合的噬菌體的篩選
　　1、噬菌體的親和篩選：以塵螨IgE陰性的過敏患者血清IgE為誘餌進行陰性篩選，獲得不能結合的噬菌體，然后再以塵螨陽性患者血清IgE抗體為誘餌進行陽性篩選，選出能夠結合的噬菌體。在篩選過程中，通過降低釣餌的濃度、減少釣餌與肽庫作用時間、增加洗脫強度，去除不能與塵螨 IgE結合和與塵螨IgE結合較弱的噬菌體，經(jīng)三輪篩選后得到富集程度較高的分別與塵螨IgE特異性結合的噬菌體克隆。
　　2

4、、挑選與IgE特異性結合的噬菌體克?。簭慕?jīng)過陰性和陽性篩選后的洗脫物中隨機挑選出100個噬菌體單克隆，通過ELISA技術進一步鑒定其與塵螨IgE結合的特異性，結果得到84個能與塵螨IgE特異性結合的噬菌體。
　　3、DNA測序與多肽合成：將84個噬菌體克隆進行DNA測序后，除去相同序列以及克隆無效的序列，最后獲得44個噬菌體克隆。將這44個噬菌體單克隆的DNA序列與塵螨主要變應原分子Derp1，Derp2，Der p5與Der p

5、7的三維結構通過軟件比對，將3個特異性強且氨基酸序列與塵螨主要變應原比對性高的噬菌體單克隆合成模擬肽。
　　二、戶塵螨模擬環(huán)肽對實驗性變應性鼻炎伴支氣管哮喘模型的作用
　　以戶塵螨誘導的變應性鼻炎伴哮喘的小鼠為模型，觀察3個合成模擬肽在體內對變應性鼻炎伴支氣管哮喘的干預作用，設正常對照組，變應性鼻炎伴哮喘模型組以及模擬肽干預組1/2/3。100μl戶塵螨提取液滴鼻致敏后，正常對照組以生理鹽水滴鼻激發(fā)，模型組與模擬肽干預組以1

6、00μl戶塵螨提取液激發(fā)。模擬肽干預組采用合成肽（500μg合成肽+200μl PBS）溶液皮下注射連續(xù)給藥干預（1次/天）4天。再次激發(fā)后處死小鼠，進行一系列觀察與檢測，結果如下：
　　1、模擬肽干預組小鼠的抓鼻、流清涕、打噴嚏的癥狀明顯改善，無口唇發(fā)紺、喘氣以及呼吸頻率加快等癥狀。
　　2、模擬肽干預組氣道阻力較模型組明顯降低。
　　3、模擬肽干預組鼻黏膜上皮細胞完整，無柱狀和杯狀細胞增生，黏膜下層無腺體增生、無中

7、性粒細胞、淋巴細胞浸潤，僅有少量嗜酸性粒細胞；模擬肽干預組肺組織血管與支氣管炎癥浸潤明顯減少、氣道上皮結構好轉。
　　4、模擬肽干預組1、2、3鼻黏膜上皮IL-25mRNA、IL-33mRNA水平明顯低于模型組；模擬肽干預組肺組織中IL-25mRNA、IL-33mRNA水平明顯低于模型組。
　　5、模擬肽干預組鼻腔與支氣管肺泡灌洗液中嗜酸性粒細胞均顯著低于模型組。
　　6、鼻腔灌洗液：模擬肽干預組IL-4水平明顯低于模

8、型組，干預組2、3 IL-10水平明顯高于模型組，干預組3中IL-25水平明顯低于模型組，干預組IFN-γ水平明顯高于模型組；肺泡灌洗液：模擬肽干預組IL-4水平明顯低于模型組，干預組1、3 IL-10水平明顯高于模型組，干預組IL-25水平明顯低于模型組，干預組1、2中IL-33水平明顯低于模型組，干預組1、3中IFN-γ水平明顯高于模型組。
　　7、模擬肽干預組血清戶塵螨特異性IgE抗體水平明顯低于模型組，而IgG1抗體水平則