屋塵螨Ⅰ、Ⅱ類變應原T細胞表位融合肽疫苗的初步研究.pdf

1、目的: 構建編碼屋塵螨變應原Derp1和Derp2的T細胞表位融合肽嵌合基因的原核表達載體pET-28a(+)-T1-8，并進行大規(guī)模的誘導表達和純化，并對純化產物的特異性免疫治療效果進行分析。
　　方法: 1）將Der p1和Der p2的8個T細胞表位用“GPGPG”序列間隔串聯(lián)為T1-8融合肽，利用DNA重組技術合成T1-8融合肽基因并插入質粒pET-28a(+)，構建pET-28a(+)-T-8載體，限制性內切酶雙酶切驗證

2、并測序。2）將重組表達載體pET-28a(+)-Tm轉化到大腸埃希菌E.coil BL21(DE3)感受態(tài)中，菌落PCR篩選陽性克隆菌。3）用IPTG小劑量誘導表達，優(yōu)化條件后進行大劑量誘導表達并純化，SDS-PAGE和Western blot(WB)驗證表達和純化產物。4）將40只BALB/c雌性小鼠隨機分為4組，分別為陰性對照組（PBS組）、陽性對照組（Asthma組）、變應原rDerp1和rDerp2混懸液治療組（rDerp1/r

3、Derp2組）以及T1-8融合肽治療組（T1-8組）。用屋塵螨粗提取液(HDM)致敏小鼠建立哮喘模型，PBS組均以PBS緩沖液代替;兩組治療組分別于小鼠致敏第25天至27天霧化致敏前30 min行背部皮下注射相應治療蛋白;最后一次霧化激發(fā)24 h后，收集各組小鼠血清、支氣管肺泡灌洗液(BALF)以及脾細胞培養(yǎng)上清(SSCC)。ELISA法檢測BALF和SSCC中特異性細胞因子IFN-γ、IL-4、IL-10、IL-17以及血清中變應原特

4、異性IgE、IgG1、IgG2a抗體水平，并行肺組織切片HE染色。
　　結果: 1）BamHⅠ/NotⅠ雙酶切結果以及測序結果顯示成功構建pET-28a(+)-T-8載體。2）菌落PCR結果顯示成功轉化至E.coil BL21(DE3)感受態(tài)中。3）SDS-PAGE以及WB驗證表明該質粒在大腸埃希菌BL21中成功表達。4）ELISA法檢鋇測結果顯示，T1-8組和rDerp1/rDerp2組與Asthma組相比， BALF和SSCC

5、中IL-4、IL-17均降低，IFN-γ、 IL-10均升高，血清中特異性IgE、IgG1降低，IgG2a升高，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）;T1-8組與rDerp1/rDerp2組相比，BALF和SSCC中IL-4、IL-17降低，IFN-γ、 IL-10升高，血清中特異性IgE、IgG1降低， IgG2a升高，均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。肺組織切片觀察表明:T1-8組和rDerp1/rDerp2組肺部炎癥較Asthma組明