PHC CTL表位肽微粒疫苗的構(gòu)建及機理研究.pdf

1、【目的】為探索有效的以表位為基礎(chǔ)的抗肝癌疫苗構(gòu)建策略,在確定針對肝癌的CTL表位疫苗設(shè)計是否適宜的基礎(chǔ)之上,從肝癌細胞表達的優(yōu)勢抗原中尋找和確定能用于CTL疫苗構(gòu)建的免疫優(yōu)勢CTL表位,然后選擇合適的載體和佐劑制備CTL表位肽疫苗,并在體外初步研究其特性和免疫學(xué)活性,以及免疫作用機制,為有效疫苗的制備和改進提供依據(jù),并為最終臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ).【方法】采用免疫組織化學(xué)LSAB法研究人肝癌組織MHC-Ⅰ類途徑重要相關(guān)分子和CTL表位肽疫苗研

2、究模型細胞株靶抗原h(huán)AFP的表達情況;運用該室建立的HLA-A2限制性CTL表位綜合預(yù)測程序A2B和國外權(quán)威預(yù)測網(wǎng)站的預(yù)測程序,綜合預(yù)測評估源自AFP的HLA-A2限制性CTL表位,從中篩選出可能自然產(chǎn)生和遞呈的候選免疫優(yōu)勢CTL表位;固相法人工合成候選表位肽,并以反相高效液相色譜和質(zhì)譜純化鑒定;通過T2細胞結(jié)合實驗和CTL殺傷分析檢測候選表位肽與HLA-A2分子的親和力和體外特異性CTL誘導(dǎo)能力,以確定候選表位是否是能自然產(chǎn)生和遞呈的

3、免疫優(yōu)勢CTL表位;以PLA為載體和佐劑,用溶劑揮發(fā)法和非溶劑沉淀法制備載肽的PLA免疫微球和免疫片粒,激光粒徑分析儀和掃描電子顯微鏡分別檢測其平均粒徑大小和形態(tài),并用紫外分光光度法測定免疫微粒的包封率和載藥量以及免疫微粒的體外釋放;體外CTL誘導(dǎo)實驗檢測免疫微粒特異性CTL誘導(dǎo)能力:考察單核-巨噬細胞對微粒的吞噬作用、微粒對巨噬細胞的毒性及活化作用,以了解微粒與巨噬細胞的相互作用和微粒免疫活性的基礎(chǔ);應(yīng)用胞內(nèi)抑制劑阻斷抗原遞呈的MHC

4、-Ⅰ類途徑相關(guān)過程,以探索PLA免疫微粒細胞遞呈的可能機制.【結(jié)論】1.該室保種的人肝癌細胞Alexander、HepG-2可用于以hAFP為靶抗原的肝癌CTL表位肽疫苗研究;2.絕大多數(shù)原發(fā)性肝細胞癌細胞可能能被特異性CTL所識別和殺傷,以AFP為靶抗原進行肝癌CTL表位肽疫苗的設(shè)計和構(gòu)建切實可行;3.絕大多數(shù)原發(fā)性肝細胞癌組織MHC-Ⅰ類遞呈途徑可能完好,提示腫瘤的免疫逃逸可能與抗原遞呈后的事件有關(guān),肝癌患者機體可能處于免疫耐受或免

5、疫抑制狀態(tài);4.該室開發(fā)的HLA-A2限制CTL表位綜合預(yù)測程序A2B和網(wǎng)絡(luò)相關(guān)資源可用于表位綜合預(yù)測評估,減少研究工作的盲目性,提高成功率;5.候選表位肽hAFP<,156-166>和hAFP<,218-226>具有與HLA-A2分子較高的親和力和較強的特異性CTL誘導(dǎo)能力,并能自然產(chǎn)生和遞呈,是HLA-A2限制的優(yōu)勢CTL表位:6.hAFP<,156-166>和hAFP<,18-226>可能具有超型意義;7.應(yīng)用PLA可以制備得到研

6、究所需要的具有良好特性的免疫微粒:8.免疫微球的體外釋放特性與片粒明顯不同,其免疫作用也可能不同;9.本室制備的四種PLA免疫微粒在體外都具有較強的、誘導(dǎo)對表達靶抗原肝癌細胞特異性殺傷CTL的能力,可能是一種有效的腫瘤CTL表位肽疫苗形式,特別是PLA免疫片粒;10.免疫微粒能為人單核-Mφ細胞高效吞噬和有效遞呈,誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性細胞免疫;11.免疫微?？赏ㄟ^在胞外釋放表位肽,直接與細胞表面MHC-Ⅰ類分子結(jié)合而遞呈;12.免疫微粒還可通