二氫楊梅素通過PPARγ-FGF21-AMPK信號通路改善胰島素抵抗的機制研究.pdf

1、糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為嚴重影響人類健康的全球性公共衛(wèi)生問題之一。2型糖尿病(T2DM)是糖尿病最常見的類型，其主要特征是骨骼肌等外周胰島素作用靶組織對胰島素敏感性下降，即胰島素抵抗(insulin resistance，IR)。IR貫穿于T2DM發(fā)生、發(fā)展的全過程，同時也是導致糖尿病各種并發(fā)癥的“動力”根源。臨床常用的降糖藥物如羅格列酮等噻唑烷二酮類(troglitazone，TZDs)等在改善IR的同

2、時可促進脂肪儲存、水鈉潴留等，長期使用毒副作用明顯，故臨床使用受到極大限制。近年來，從天然植物化合物中篩選無毒副作用的新型降糖藥物已成為胰島素增敏劑類T2DM治療藥物的主要發(fā)展方向之一。
　　大量研究顯示，膳食來源的植物化合物具有顯著的健康保護效應，是藥物研發(fā)很好的潛在供體。一些廣泛存在于蔬菜水果中的黃酮類化合物如木犀草素(luteolin)、山奈酚(kaempferol)、槲皮素(quercetin)等已被發(fā)現(xiàn)可降低血糖，增加胰

3、島素敏感性而調(diào)節(jié)糖代謝。二氫楊梅素(dihydromyricetin，DHM)，又名蛇葡萄素(ampelopsin，AMP)是藥食兩用植物藤茶（也稱霉茶）中含量很高的一種黃酮類化合物，在嫩莖葉中含量高達20％以上（以干重計）。DHM分子結構與槲皮素、木犀草素極為相似，已被證實具有抗氧化、解酒保肝、抗腫瘤等多種藥理功效。有動物實驗報道，二氫楊梅素可降低四氧嘧啶誘導的糖尿病小鼠血糖，但其具體作用機制尚未明確。
　　過氧化物酶體增殖物激

4、活受體-γ(peroxisome proliferator-activated receptor, PPARγ)是Ⅱ型核激素受體超家族成員之一，與機體糖脂代謝調(diào)節(jié)密切有關。臨床常用的降糖藥物羅格列酮等噻唑烷二酮類(TZDs)就是以PPARγ為作用靶標的胰島素增敏劑，可有效改善IR。有研究表明在脂肪細胞中，PPARγ激動劑可誘導成纖維細胞生長因子-21（fibroblast growth factor，F(xiàn)GF21）的表達，從而進一步增加P

5、PARγ的活性;而FGF21又可激活AMP依賴的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)，增強線粒體功能和氧化能力，從而改善糖耐量。本實驗室另一課題組研究發(fā)現(xiàn)DHM可激活AMPK促進線粒體生成，進而改善大鼠在急性低氧條件下的體能下降。因此推測，藤茶提取物及DHM可能通過激活PPARγ、上調(diào)FGF21的表達，活化AMPK信號通路來實現(xiàn)改善胰島素抵抗的作用。
　　本研究首先用高脂喂養(yǎng)SD大鼠并聯(lián)合

6、小劑量鏈脲佐菌素腹腔注射(STZ，30mg/kg)建立T2DM大鼠模型。建模成功后將T2DM大鼠隨機分為糖尿病模型組(DIA)、二甲雙胍組(MET,125 mg/kg)、二氫楊梅素組（DHM，100mg/kg）、藤茶提取物低劑量組（R50，50 mg/kg）、中劑量組(R100，100 mg/kg)及高劑量組（R200，200 mg/kg）6組。每組大鼠分別灌胃給藥干預4周后，放射免疫分析法測定大鼠血清中胰島素、胰島素C肽;ELISA法

7、測定大鼠血清FGF21水平;western blot法檢測肌肉組織中IRS-1、Akt、FGF21、AMPK、PPARγ蛋白表達;qRT-PCR法檢測肌肉組織中FGF21、PPARγ mRNA的表達，觀察藤茶提取物改善胰島素抵抗的效果;其次，以棕櫚酸(Palmitic acid，PA)誘導L6骨骼肌成肌細胞建立胰島素抵抗體外模型，進一步探討DHM改善胰島素抵抗的作用及其分子機制，為糖尿病的防治尋找新的策略，同時為新型降糖藥物的研發(fā)提供實

8、驗基礎。
　　主要結果與結論:
　　1.體內(nèi)實驗結果:藤茶提取物及二氫楊梅素可改善糖尿病大鼠的肌纖維萎縮、變性等炎性改變。與糖尿病組相比，二甲雙胍組、二氫楊梅素組和藤茶提取物組大鼠血糖、血清胰島素水平、HOMA-IR指數(shù)、血清FGF21水平顯著降低(P＜0.05)，而胰島素C肽水平顯著升高(P＜0.05);肌肉組織中pIRS-1、pAkt、 pAMPK、FGF21、PPARγ蛋白表達上調(diào)，同時FGF21、PPARγ mRNA

9、的表達升高(P＜0.05)，提示藤茶提取物及二氫楊梅素可顯著改善STZ誘導的糖尿病大鼠的胰島素抵抗。
　　2.體外實驗結果
　　(1) DHM可劑量依賴和時間依賴增強PA誘導的胰島素抵抗的L6細胞的葡萄糖攝取能力，并上調(diào)胰島素信號通路相關蛋白pAkt、pIRS-1的表達，提示DHM可有效改善PA誘導的骨骼肌細胞胰島素抵抗。
　　(2) DHM劑量依賴和時間依賴的激活AMPK，AMPK特異性抑制劑Compound C和A

10、MPK siRNA明顯抑制DHM介導的AMPK激活，并降低DHM介導的胰島素抵抗的L6細胞葡萄糖攝取能力增強，并且pAkt、pIRS-1的表達水平升高，提示DHM改善L6骨骼肌細胞胰島素抵抗作用可能與其激活AMPK有關。
　　(3) DHM劑量依賴和時間依賴的上調(diào)胰島素抵抗的L6細胞FGF21的表達，F(xiàn)GF21siRNA顯著抑制DHM對AMPK的激活作用，降低DHM介導的胰島素抵抗的L6細胞葡萄糖攝取能力增強以及pIRS-1，pA

11、kt的表達的上調(diào)，提示DHM通過上調(diào)FGF21的表達激活AMPK，進而發(fā)揮改善L6骨骼肌細胞胰島素抵抗的作用。
　　(4) DHM劑量依賴和時間依賴的增加PPARγ的表達，而PPARγ特異性抑制劑GW6992和PPARγ siRNA能顯著抑制DHM介導的FGF21表達上調(diào)和對AMPK的激活作用，抑制DHM誘導的pIRS-1、pAkt的表達的上調(diào)作用，進而降低DHM增強胰島素抵抗的L6細胞葡萄糖攝取能力的作用，提示DHM通過激活PP