胸腺素β4對毛囊重建的作用研究.pdf

1、脫發(fā)是困擾許多人的問題，但數(shù)十年來其治療少有突破。目前的脫發(fā)治療藥物多是通過減緩毛囊損失或刺激毛發(fā)增長來發(fā)揮作用，而毛發(fā)移植也只是將其他部位的毛囊移到缺損部，尚不能從根本上解決問題。因此，促進(jìn)毛囊再生才是解決脫發(fā)的關(guān)鍵。國內(nèi)外關(guān)于毛囊重建的研究表明，毛囊重建的影響因素主要有表皮和真皮來源的種子細(xì)胞及其微環(huán)境。目前，采用鼠來源的種子細(xì)胞能成功重建毛囊，而大多數(shù)文獻(xiàn)表明采用人來源的種子細(xì)胞尚不能實(shí)現(xiàn)毛囊重建。胸腺素β4是由43個(gè)氨基酸殘基組

2、成的多肽，最初從胸腺中分離純化獲得，后被發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)分布廣泛。胸腺素β4在調(diào)節(jié)免疫和神經(jīng)功能方面具有重要作用，也能促進(jìn)血管生成以及創(chuàng)傷愈合，并促進(jìn)大小鼠毛發(fā)生長。但是關(guān)于胸腺素β4對人毛囊重建的作用仍了解甚少。本研究運(yùn)用胸腺素β4體外刺激人來源的毛囊外根鞘細(xì)胞和真皮毛乳頭細(xì)胞，探討胸腺素β4在體外對毛囊重建種子細(xì)胞的作用;同時(shí)，建立毛囊重建小室模型并應(yīng)用此模型評價(jià)胸腺素β4對鼠毛囊重建的作用。
　　研究目的:
　　1.檢測胸腺

3、素β4對體外培養(yǎng)的人毛囊外根鞘細(xì)胞和真皮毛乳頭細(xì)胞的作用
　　2.構(gòu)建毛囊重建小室模型
　　3.應(yīng)用小室模型評價(jià)胸腺素β4對鼠毛囊重建的作用
　　研究方法和結(jié)果:
　　1.人毛囊外根鞘細(xì)胞和人真皮毛乳頭細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定
　　方法:取美容術(shù)后多余頭皮組織，切下含毛乳頭的脂肪層，經(jīng)0.2％的Ⅰ型膠原酶消化后顯微鏡下挑選水滴樣毛乳頭組織并進(jìn)行貼壁培養(yǎng);剩余頭皮組織切成卜2mm細(xì)條，于0.25％中性蛋白酶溶液

4、中浸泡過夜，將頭發(fā)拔出后于體視顯微鏡下取毛囊外根鞘中段，胰酶消化后獲取人毛囊外根鞘細(xì)胞并接種培養(yǎng)。觀察外根鞘細(xì)胞和毛乳頭細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)，并通過免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)以及特殊染色鑒定人毛囊外根鞘細(xì)胞和真皮毛乳頭細(xì)胞。
　　結(jié)果:通過顯微解剖法獲得的人毛囊外根鞘細(xì)胞具有較強(qiáng)的增殖能力，接種2-3小時(shí)后即可發(fā)現(xiàn)有少量細(xì)胞貼壁，呈鋪路石狀，符合典型上皮樣細(xì)胞特點(diǎn)，7-10天可見細(xì)胞融合;免疫熒光染色和流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明人毛囊外根鞘細(xì)胞陽

5、性表達(dá)Sox9和CD49f等標(biāo)志性基因。應(yīng)用一步酶消化法及水滴狀毛乳頭組織的鏡下挑選獲得的真皮毛乳頭細(xì)胞純度較高，受真皮成纖維細(xì)胞的污染較少，接種2-3天后可見真皮毛乳頭細(xì)胞從毛乳頭組織中遷出，且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，真皮毛乳頭細(xì)胞遷出增多，呈長梭形，堿性磷酸酶染色結(jié)果表明該細(xì)胞表達(dá)毛乳頭細(xì)胞的標(biāo)志性基因堿性磷酸酶。
　　2.檢測胸腺素β4對體外培養(yǎng)的人毛囊外根鞘細(xì)胞的作用
　　方法:體外培養(yǎng)人毛囊外根鞘細(xì)胞的過程中分別向培養(yǎng)

6、基中添加不同濃度的胸腺素β4，終濃度分別為10ng/mL、100ng/mL和1000ng/mL，經(jīng)培養(yǎng)24h后觀察其形態(tài)學(xué)改變，獲取細(xì)胞并提取RNA，應(yīng)用Real-Time PCR的方法檢測胸腺素β4對人毛囊外根鞘細(xì)胞中毛發(fā)發(fā)育和再生相關(guān)基因的表達(dá)。
　　結(jié)果:人毛囊外根鞘細(xì)胞經(jīng)不同濃度胸腺素β4處理后，形態(tài)學(xué)上與未添加藥物的對照組未見明顯差異;添加不同濃度胸腺素β4處理后的人外根鞘細(xì)胞中關(guān)于毛囊干細(xì)胞標(biāo)志性基因Sox9、EPCA

7、M、TCF3，細(xì)胞與微環(huán)境相互作用的基因VEGF、Integrinα3、Integrinα5，毛囊再生相關(guān)信號通路中如Wnt、EDA等關(guān)鍵基因Lef1、EDA、CCN2、PDGFA、Follistatin、Nfatc1的表達(dá)，與未添加藥物的對照組相比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;各濃度組間未見明顯差異。
　　3.檢測胸腺素β4對體外培養(yǎng)的人真皮毛乳頭細(xì)胞的作用
　　方法:體外培養(yǎng)人真皮毛乳頭細(xì)胞過程中分別向培養(yǎng)基中添加不同濃度的胸腺素β4

8、，終濃度分別為10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL，經(jīng)培養(yǎng)24h后觀察其形態(tài)學(xué)改變，獲取細(xì)胞并提取RNA，應(yīng)用Real-Time PCR的方法檢測胸腺素β4對人真皮毛乳頭細(xì)胞中毛發(fā)發(fā)育和再生相關(guān)基因的表達(dá)，對于有明顯改變的基因用WesternBlot進(jìn)行驗(yàn)證。
　　結(jié)果:人真皮毛乳頭細(xì)胞經(jīng)不同濃度胸腺素β4處理后，形態(tài)學(xué)上與未添加藥物的對照組相比未見明顯差異;添加不同濃度胸腺素β4處理后的人毛乳頭細(xì)胞中關(guān)于真皮毛乳

9、頭誘導(dǎo)毛囊再生相關(guān)基因ALP、α-SMA、ACTG2、TRPS1、SERPINF1、PTGER3，細(xì)胞與微環(huán)境相互作用的基因VEGF、HGF、Laminin5的表達(dá)，與未添加藥物的對照組相比未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，且各濃度組間也未見明顯差異。而纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)在添加胸腺素β4的人毛乳頭細(xì)胞中的表達(dá)較對照組有明顯升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Western Blot也進(jìn)一步驗(yàn)證了FN表達(dá)的上調(diào)。
　　4.構(gòu)建毛囊重建小室模型

10、
　　方法:采用直徑1cm的聚乙烯瓶內(nèi)塞作為小室，在裸鼠背部剪一直徑約1cm的全層皮膚缺損創(chuàng)面，將小室植入，縫合小室周邊皮膚以固定。分離C57BL/6新生小鼠的表皮和真皮細(xì)胞，混合后注入小室內(nèi)。7天后拆除小室并開始觀察創(chuàng)口部位的毛囊重建情況。30天后對創(chuàng)口部位皮膚取材并進(jìn)行HE染色，對其形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。
　　結(jié)果:裸鼠創(chuàng)口小室植入部位可見毛囊重建，新生毛發(fā)大體觀和鏡下觀與正常無明顯差異，且排列極性、生長密度良好。對部分無毛

11、囊重建的創(chuàng)口分析，發(fā)現(xiàn)模型構(gòu)建中小室植入的位置對毛囊再生的成功具有重要的影響。
　　5.應(yīng)用小室模型評價(jià)胸腺素β4對鼠毛囊重建的作用
　　方法:小室模型的建立同上，在重懸細(xì)胞時(shí)加入不同濃度的胸腺素β4混勻，使其終濃度分別為10ng/mL、100ng/mL、1000ng/mL，并連續(xù)6天在小室中繼續(xù)加入不同濃度的胸腺素β4。7天后拆除小室并開始觀察創(chuàng)口部位的毛囊重建情況。30天后對創(chuàng)口部位皮膚取材并進(jìn)行HE染色，對其形態(tài)結(jié)構(gòu)進(jìn)