花鱸肌肉生長(zhǎng)抑素基因（MSTN）克隆、表達(dá)及其基因打靶載體的構(gòu)建.pdf

1、物質(zhì)損傷線粒體，降低線粒體膜電位，增加細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度及顯著抑制PCNA表達(dá)，增強(qiáng)Caspase-3活性和降低C—fos和C-jun蛋白表達(dá)有關(guān)。泥蚶多肽在50mg／kg、100mg／kg、200mg／kg劑量范圍內(nèi)，對(duì)荷Lewis肺癌小鼠的腫瘤具有抑制作用，其機(jī)理與該物質(zhì)降低bcl-2mRNA、P53和P16蛋白在腫瘤組織中的表達(dá)，增高Bax蛋白的表達(dá)有關(guān)，但并不影響腫瘤組織中fas mRNA和C-myc的表達(dá)。毒理學(xué)研究結(jié)果表明，泥

2、蚶多肽對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)次數(shù)和麻醉犬心率、血壓、心電圖各間期及呼吸頻率和深度無(wú)明顯影響。小鼠靜脈注射的最大耐受量大于2g／kg，小鼠皮下注射的最大耐受量大于5g／kg。長(zhǎng)期靜脈注射本物質(zhì)對(duì)Beagle犬體重、血液學(xué)指標(biāo)、血液生化指標(biāo)、心電圖、尿常規(guī)均無(wú)明顯影響，對(duì)24個(gè)臟器病理組織檢查均無(wú)明顯影響。Ames實(shí)驗(yàn)證明泥蚶多肽的Ames實(shí)驗(yàn)為陰性結(jié)果；對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果提示，其對(duì)動(dòng)物體細(xì)胞沒(méi)有明顯的致突變作用；對(duì)小鼠睪丸精原細(xì)胞染色體畸

3、變實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，其對(duì)動(dòng)物生殖細(xì)胞也沒(méi)有明顯的致突變作用。靜脈注射250mg／kg、100mg／kg、50mg／kg、10mg/Kg泥蚶多肽對(duì)孕鼠體重、胚胎形成、胎鼠生長(zhǎng)發(fā)育、胎鼠骨骼發(fā)育以及胎鼠內(nèi)臟器官等觀察指標(biāo)無(wú)明顯影響。 綜上所述，本研究結(jié)果證實(shí)泥蚶多肽具有明顯的體外、體內(nèi)抗腫瘤作用，作為一種小分子多肽，無(wú)明顯的毒副作用，還能提高機(jī)體的免疫功能。顯然，這種獨(dú)特的雙重作用有利于腫瘤病人的綜合治療和康復(fù)。本研究為進(jìn)一步開發(fā)、應(yīng)用

4、泥蚶生物資源，造福人類提供客觀依據(jù)，預(yù)示著作為一種潛在的藥用海洋生物，泥蚶具有巨大的開發(fā)應(yīng)用價(jià)值。 選擇程序構(gòu)建了MSTN同源重組載體，命名為p-MSTN-NK。同源重組載體p-MSTN-NK被轉(zhuǎn)移到LJESl細(xì)胞中，2天后，500 μg／ml G418用于正選擇，2.5 μg／ml GANC用于負(fù)選擇。經(jīng)過(guò)25天的藥物選擇，轉(zhuǎn)化空載體pBluescript ll KS的對(duì)照組細(xì)胞全部死亡；經(jīng)G418篩選轉(zhuǎn)化了p-MSTN-NK

5、的一組細(xì)胞形成了大約2000個(gè)抗性克隆；經(jīng)G418和GANC雙選擇轉(zhuǎn)化了p-MSTN-NK的另一組細(xì)胞平均獲得了43個(gè)雙抗性克隆，負(fù)篩選使同源重組富集效率大約為51倍。最終，在多批轉(zhuǎn)化的細(xì)胞中，28個(gè)雙選擇克隆被擴(kuò)增培養(yǎng)。 總之，本文首次克隆獲得了5396 bp的MSTN基因組序列。通過(guò)RT-PCR技術(shù)和MSTN基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GFP基因的表達(dá)，特征了MSTN基因在不同組織、不同胚胎發(fā)育時(shí)期及幾個(gè)不同細(xì)胞系中的表達(dá)方式。另一方面，