激光共聚焦和雙光子顯微鏡對細胞的成像及植物細胞Cytomixis的研究.pdf

1、近十年來，由于生物熒光成像技術(shù)和熒光探針技術(shù)的飛速發(fā)展，以及生物活體組織和細胞的三維成像在生命科學研究中的重要意義，目前，激光共聚焦掃描顯微鏡(Confocal Laser Scanning Microcopy，簡稱CLSM)是生物細胞和組織的三維成像最有效的設(shè)備，已經(jīng)普遍的在各個實驗室廣泛應(yīng)用。但由于一些因素的制約，成像效果還沒有達到非常理想的目標。近年來，光學顯微鏡技術(shù)中的一個最引人注目的成就是雙光子激發(fā)現(xiàn)象(Two Photon

2、Excitation，簡稱TPE)在激光共聚焦掃描顯微鏡中的廣泛應(yīng)用。雙光子技術(shù)可以使我們無需使用紫外光源就能達到檢測紫外熒光探針的目的。雙光子激光高度的三維空間分辨性(激發(fā)在很小的三次方空間內(nèi))和大的穿透深度使雙光子熒光成像技術(shù)迅速在生物細胞和組織(尤其是植物細胞組織)的活體三維成像研究方面獲得了廣泛的應(yīng)用。
　　 同樣，利用雙光子激光掃描顯微鏡對活體細胞成像也存在一個關(guān)鍵問題：那就是目前缺乏有效的雙光子熒光探針，因而利用傳統(tǒng)

3、熒光探針，雙光子激光掃描顯微鏡也很難使不透明的、較厚的活體組織在較深的層面上進行清晰的熒光成像，目前國際上在活體植物不透明組織中成像研究中的最好記錄是60-70nm，這也是當前生物學界對激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激光掃描顯微鏡在應(yīng)用中存在爭論的焦點所在。因此，缺乏大吸收截面的熒光探針分子嚴重制約了雙光子激光掃描顯微鏡的廣泛應(yīng)用。
　　 本文首先通過利用各種傳統(tǒng)的熒光探針和激光共聚焦顯微鏡以及雙光子激光掃描顯微鏡，對各種細胞及細

4、胞內(nèi)的成分進行成像研究，從而對激光共聚焦顯微鏡及雙光子激光掃描顯微鏡細胞成像的技術(shù)有一個深入的研究和總結(jié)。其次，通過研究雙光子熒光探針的特性，我們合成并表征了幾個具有高靈敏度、高雙光子吸收截面的雙光子核酸熒光探針，BMVEC、9E-BHVC和2,7-BHVC，同時利用這些探針對細胞核的雙光子成像進行了系統(tǒng)的研究，為生命科學工作者們提供了幾個細胞膜半通透性的、真正意義上的雙光子核酸熒光探針。第三，通過利用高效熒光探針和激光共聚焦顯微鏡以及