小鼠8-細(xì)胞胚胎單-卵裂球的體外培養(yǎng)及其囊胚類胚胎干細(xì)胞的初步分離與鑒定.pdf

1、分離培養(yǎng)單個(gè)卵裂球生產(chǎn)同卵雙胎或一卵多胎動(dòng)物已有成功報(bào)道；提取體外受精胚胎單個(gè)卵裂球活體檢測(cè)著床前胚胎的基因遺傳問(wèn)題是人醫(yī)臨床診斷的熱門課題(PGD診斷)；利用小鼠不同發(fā)育階段的早期胚胎分離培養(yǎng)卵裂球獲取胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ES細(xì)胞)的實(shí)驗(yàn)研究是近期研究胚胎干細(xì)胞來(lái)源的熱點(diǎn)之一。
　　 以上研究?jī)?nèi)容是近十年來(lái)以早期胚胎卵裂球的分離培養(yǎng)為研究手段，為尋求動(dòng)物快速擴(kuò)繁新途徑、探索人類生前遺傳病診斷方

2、式和尋求無(wú)倫理爭(zhēng)議的人體自身ES細(xì)胞生前儲(chǔ)備庫(kù)的有效方法的三個(gè)不同目的所開展的研究。以上三方面的研究報(bào)道很多，在羊和牛已經(jīng)獲得了來(lái)源于2-細(xì)胞和4-細(xì)胞胚胎的單個(gè)卵裂球的活體后代，在兔獲得了來(lái)源于4-細(xì)胞胚胎的單個(gè)卵裂球后代，在豬獲得了8-細(xì)胞單個(gè)卵裂球后代。通過(guò)活組織檢查卵裂球途徑建立ES細(xì)胞系的成功率很低，而且不是所有的姐妹卵裂球都能建立ES細(xì)胞系，由此引發(fā)了姐妹卵裂球是否都具有相同的衍生成ES細(xì)胞的能力或是否具有不同的命運(yùn)，卵裂球

3、的選取可能減少供體細(xì)胞的發(fā)育能力，因此確定隨機(jī)選取單卵裂球產(chǎn)生ES細(xì)胞是否破壞胚胎的完整性以及是否危害胚胎的后續(xù)發(fā)育，是一個(gè)十分重要的問(wèn)題。小鼠單個(gè)卵裂球培養(yǎng)后，ES細(xì)胞的建系成功率與胚胎的細(xì)胞分裂次數(shù)或胚胎細(xì)胞的發(fā)育階段具有成反比趨勢(shì)，這些結(jié)果顯示出每一個(gè)胚胎階段并不是所有卵裂球，而是只有一個(gè)或兩個(gè)卵裂球有衍生成ES細(xì)胞的能力。以上三方面的研究報(bào)道均表明各自方向都有成功潛力，成功率很低，影響成功率的焦點(diǎn)問(wèn)題主要集中在單一卵裂球的質(zhì)量上

4、，這種質(zhì)量問(wèn)題是由于早期胚胎在分裂增殖過(guò)程中因時(shí)序所致的決定因子分布不均所引起，或是眾多研究者沿用的早期胚胎培養(yǎng)基不能滿足單一卵裂球更高的無(wú)分化性增殖的培養(yǎng)條件所致，前者是遺傳性的，后者是后天獲得性的問(wèn)題。
　　 本試驗(yàn)針對(duì)后者，以昆明小鼠為實(shí)驗(yàn)材料，以培養(yǎng)體外受精8-細(xì)胞胚胎卵裂球生成囊胚后分離培養(yǎng)出類胚胎干細(xì)胞的效果為主要檢測(cè)目標(biāo)，從改善體外受精胚胎的早期培養(yǎng)條件入手，探索體外受精8-細(xì)胞胚胎單個(gè)卵裂球的體外培養(yǎng)體系，因此設(shè)

5、計(jì)以下3個(gè)試驗(yàn)，旨在觀察單個(gè)卵裂球體外培養(yǎng)條件對(duì)其干細(xì)胞生產(chǎn)的非遺傳因素作用，為ES細(xì)胞的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。試驗(yàn)總結(jié)如下：
　　 試驗(yàn)一：8-細(xì)胞體外受精胚胎單一卵裂球培養(yǎng)基的選擇與優(yōu)化本試驗(yàn)在分析和選擇小鼠早期體外受精胚胎培養(yǎng)液的基礎(chǔ)上，自制不含抗氧化劑的CZB'培養(yǎng)液，以此為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，通過(guò)添加不同濃度維生素E、半胱氨酸或L-谷氨酰胺等抗氧化劑，觀察抗氧化培養(yǎng)對(duì)體外受精胚胎2-細(xì)胞、4-細(xì)胞、8-細(xì)胞和桑囊胚發(fā)育率的作用，旨

6、在改進(jìn)小鼠早期體外受精胚胎培養(yǎng)體系的基礎(chǔ)上，為選取小鼠體外受精8-細(xì)胞胚胎單個(gè)卵裂球的培養(yǎng)基奠定基礎(chǔ)。結(jié)果顯示：0.15 mg·ml-1 L-谷氨酰胺處理組、0.05 mg·ml-1半胱氨酸處理組、100μmol·L-1 VE處理組的抗氧化培育效果均優(yōu)于對(duì)照組，能顯著提高體外受精胚胎的2-細(xì)胞(68.68％、61.35％、67.88％VS53.14％)、4-細(xì)胞(51.77％、49.72％、50.71％VS27.83％)、8-細(xì)胞率(4

7、2.18％、41.32％、40.52％VS17.70％)和桑囊胚發(fā)育率(33.75％、32.37％、30.89％VS12.70％)。結(jié)果表明：在實(shí)驗(yàn)室自配的CZB'培養(yǎng)液中添加適宜濃度的抗氧化劑對(duì)昆明小鼠體外受精胚胎進(jìn)行抗氧化培養(yǎng)效果較好，使用這種抗氧化培養(yǎng)基可以作為體外受精8-細(xì)胞單個(gè)卵裂球的基礎(chǔ)培養(yǎng)液。
　　 試驗(yàn)二：8-細(xì)胞體外受精胚胎單一卵裂球的培養(yǎng)方法研究在試驗(yàn)一的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)選取抗氧化性早期胚胎培養(yǎng)基CZB培養(yǎng)液作

8、為8-細(xì)胞胚胎單一卵裂球的培養(yǎng)液，通過(guò)改進(jìn)細(xì)胞的共培養(yǎng)體系、比較人工透明帶使用效果和觀察有限培養(yǎng)液內(nèi)卵裂球培養(yǎng)密度對(duì)其培養(yǎng)效果的影響，從這三個(gè)途徑入手，研究體外培養(yǎng)單一卵裂球的有效培養(yǎng)方法。結(jié)果顯示：比較小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(Mouse embryonic fibroblast，MEF)原代(7.33％)、MEF3代(15.90％)、MEF6代(0.68％)共培養(yǎng)體系，小鼠子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系(16.06％)，小鼠顆粒細(xì)胞共培養(yǎng)體系(1

9、0.53％)等對(duì)單個(gè)卵裂球發(fā)育的影響，MEF3代共培養(yǎng)體系和子宮內(nèi)膜細(xì)胞共培養(yǎng)體系更有助于提高8-細(xì)胞單個(gè)卵裂球發(fā)育能力和囊胚率，與對(duì)照組相比差異顯著(15.90％、16.06％VS3.48％)；將單一卵裂球放入人工透明帶內(nèi)培養(yǎng)其囊胚發(fā)育率沒有得到明顯改善(16.15％VS15.87％)，但有透明帶培養(yǎng)的多腔囊胚率要顯著低于無(wú)透明帶培養(yǎng)(1.09％VS4.63％)；在培養(yǎng)微滴中采取10個(gè)·20μl-1培養(yǎng)密度培養(yǎng)能顯著提高囊胚率(18.

10、44％VS1.4.33％)。結(jié)果表明：選取MEF3代共培養(yǎng)體系，用包裹透明帶的方法，以10個(gè)·20μl-1培養(yǎng)密度培養(yǎng)能顯著增強(qiáng)單一卵裂球的體外發(fā)育能力和囊胚出現(xiàn)比率。
　　 試驗(yàn)三：來(lái)源于8-細(xì)胞胚胎單一卵裂球囊胚類干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與鑒定本試驗(yàn)在獲得由單一卵裂球發(fā)育而來(lái)的小鼠囊胚后，從共培養(yǎng)體系中通過(guò)全胚飼養(yǎng)層法培養(yǎng)，再經(jīng)過(guò)顯微外科手段挑選出增殖的囊胚內(nèi)細(xì)胞團(tuán)(Inner cell mass，ICM)集落，進(jìn)一步通過(guò)對(duì)內(nèi)細(xì)胞

11、團(tuán)的離散、分離、培養(yǎng)，最后通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、堿性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)染色和體外分化試驗(yàn)，初步鑒定來(lái)源于小鼠8-細(xì)胞體外受精胚胎單一卵裂球的類胚胎干細(xì)胞。結(jié)果顯示：分離所得細(xì)胞集落與飼養(yǎng)層界線清楚，表面光滑，細(xì)胞致密，集落呈典型的鳥巢狀，顯微鏡下觀察，細(xì)胞體積小但核很大，符合ES細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征；AKP試劑盒檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該種細(xì)胞被染成紅色，且周圍飼養(yǎng)層細(xì)胞不著色；將該種細(xì)胞集落挑出，接種于不加白血病抑制因子

12、(Leukemia Inhibitory Factor，LIF)的ES細(xì)胞培養(yǎng)液中，發(fā)現(xiàn)該種細(xì)胞開始分化。結(jié)果表明：這種來(lái)源于小鼠體外受精8-細(xì)胞胚胎單一卵裂球的細(xì)胞集落，經(jīng)過(guò)初步鑒定可以判定為類ES細(xì)胞。
　　 結(jié)論：在分析和選擇幾種小鼠常用體外受精胚胎培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，本試驗(yàn)自制的抗氧化培養(yǎng)基能夠有效改進(jìn)體外受精胚胎的培養(yǎng)效果；以此培養(yǎng)基作為小鼠8-細(xì)胞體外受精胚胎單一卵裂球的基礎(chǔ)培養(yǎng)液，對(duì)單一卵裂球的培養(yǎng)方法進(jìn)行研究表明，采