海洋環(huán)己酮降解菌及環(huán)己酮降解基因的研究.pdf

1、“21世紀(jì)是手性化學(xué)發(fā)展的世紀(jì)”， 2001年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)就授予分子手性催化的主要貢獻(xiàn)者。很多藥物及生物活性物質(zhì)是具有手性特征的，手性制藥是目前醫(yī)藥行業(yè)的前沿領(lǐng)域和高速增長的領(lǐng)域，是各大制藥企業(yè)競爭的熱點(diǎn)之一，手性技術(shù)也是21世紀(jì)勢必快速發(fā)展的領(lǐng)域。不僅僅是醫(yī)藥領(lǐng)域，食品，化工，微電子，材料，等眾多領(lǐng)域都會因?yàn)槭中约夹g(shù)的發(fā)展得到巨大改變。而目前所有手性催化劑中，將酮催化為具有手性的酯的最佳催化劑是在不動(dòng)桿菌中發(fā)現(xiàn)的環(huán)己酮單加氧酶。

2、 本文從太平洋深海獲得了一株可利用環(huán)己酮為唯一碳源進(jìn)行生長的微球菌CN1，該菌不僅表現(xiàn)出除轉(zhuǎn)化環(huán)己酮外的諸多性能。如不具有致病性，生長速度快，而且可耐受高濃度環(huán)己酮(>44％)，并且在16％(V/V)的環(huán)己酮中生長最好。CN1可在12mM的重鉻酸鉀中生長，可利用高濃度氰化鉀(250mM)，還能產(chǎn)生植物生長素——吲哚乙酸。而CN1表現(xiàn)的最重要的功能是，它可以高轉(zhuǎn)化率，高手性率的將極為廉價(jià)的非手性藥物中間體雙環(huán)[3，2，0]-2-雙鍵-

3、6-酮加氧轉(zhuǎn)化為極為昂貴的手性酯，生成物與反應(yīng)物的市場價(jià)格相差近1000倍。 不同于已有報(bào)道，環(huán)戊酮卻不能被CN1轉(zhuǎn)化，表明CN1中的環(huán)己酮加氧酶有著較為特別的底物利用范圍。環(huán)己酮可被CN1降解，環(huán)己醇可轉(zhuǎn)化為環(huán)己酮后降解，環(huán)己醇又阻礙自身通過環(huán)己酮途徑降解。環(huán)己酮在氧氣不充足或環(huán)己酮較多的情況下，轉(zhuǎn)化為環(huán)己醇。通過分析環(huán)己酮降解的中間代謝產(chǎn)物發(fā)現(xiàn)，環(huán)己酮有多種途徑進(jìn)行代謝，不僅可通過B-氧化途徑降解，通過轉(zhuǎn)化為環(huán)己醇后合成其

4、他物質(zhì)，還有可能直接水解。 通過Southern雜交，結(jié)合基因組文庫構(gòu)建，獲得了環(huán)己酮降解的完整基因簇。整個(gè)基因簇與具有高GC含量的紅球菌，節(jié)桿菌的基因簇比較接近，而與目前研究的較深入的不動(dòng)桿菌的基因簇?zé)o論從單個(gè)基因還是基因排布還是調(diào)控基因的類型上都差別很大。通過反轉(zhuǎn)錄結(jié)合PCR發(fā)現(xiàn)CN1的這個(gè)基因簇與阿拉伯糖操縱子有很高的相似性，其兩個(gè)啟動(dòng)子緊挨著位于基因簇中部，并在環(huán)己酮誘導(dǎo)的情況下向相反的方向轉(zhuǎn)錄。利用GC-MS驗(yàn)證環(huán)己

5、醇脫氫酶和環(huán)己酮加氧酶的轉(zhuǎn)化功能，并且還發(fā)現(xiàn)在環(huán)己醇脫氫酶與環(huán)己酮加氧酶共表達(dá)的條件下，前者的活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后者。在大腸桿菌中異源表達(dá)了CN1的環(huán)己酮單加氧酶，發(fā)現(xiàn)大都形成了包涵體，通過稀釋復(fù)性從而獲得了有活性的酶。 通過構(gòu)建了CN1環(huán)己酮單加氧酶及所有BVMO家族蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)合系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)BVMO家族蛋白中心相當(dāng)保守，發(fā)現(xiàn)并推測一條保守的多肽對于酶的性質(zhì)影響很大，不認(rèn)同一些學(xué)者對BVMO催化中心的見解，提出了B

6、VMO蛋白有額外的底物結(jié)合區(qū)，和新的催化機(jī)理模型。 此外，通過組合碳源，富集培養(yǎng)基，篩選培養(yǎng)基等要素，從印度洋熱液口的一個(gè)泥樣中分離到30個(gè)屬的116株細(xì)菌，其中16株菌的16SRNA序列與網(wǎng)上比對的最高相似度低于或等于97％。通過GC-MS檢測發(fā)現(xiàn)其中有19株可轉(zhuǎn)化環(huán)己酮，隨機(jī)選9株菌進(jìn)行southern雜交驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)這些菌中確實(shí)含有環(huán)己酮加氧酶。與已報(bào)道的篩菌方法相比不僅開創(chuàng)了新的環(huán)己酮降解菌的高效篩選方法，而且在一個(gè)泥樣