人乳鐵蛋白在山羊乳腺上皮細(xì)胞中的表達(dá)及核移植研究.pdf

1、本研究旨在將人乳鐵蛋白基因乳腺特異性表達(dá)載體PBLM-C1，用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的沙能奶山羊乳腺上皮細(xì)胞，應(yīng)用G418篩選及PCR檢測獲得陽性細(xì)胞，并對細(xì)胞進(jìn)行激素(催乳素+胰島素+氫化可的松)誘導(dǎo)，Westernblot檢測細(xì)胞上清液有目的蛋白表達(dá)。之后以該轉(zhuǎn)染細(xì)胞為供核體細(xì)胞進(jìn)行核移植試驗，并對轉(zhuǎn)基因克隆胚在早期發(fā)育過程中外源基因的表達(dá)進(jìn)行PCR檢測，為獲得轉(zhuǎn)基因動物個體奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下： 1.原代培養(yǎng)的山羊乳腺上皮

2、細(xì)胞，大多細(xì)胞形態(tài)呈短梭型、多角形，也有部分呈圓餅狀，體積較大，體外培養(yǎng)過程中可形成島嶼狀單層聚集和類似圓頂狀的結(jié)構(gòu)。傳至第三代進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗。 2.純化的質(zhì)粒載體和質(zhì)脂體依據(jù)一定的比例混合后，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞，經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞克隆形成率較高，可見到陽性細(xì)胞形成的島嶼狀細(xì)胞群。 3.利用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的山羊乳腺上皮細(xì)胞，400μg/mL的G418的培養(yǎng)液連續(xù)篩選2周，然后用200μg/mL的G41

3、8低濃度培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染細(xì)胞提取基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，電泳結(jié)果表明該載體成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞中。 4.對轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行激素誘導(dǎo)，加入含胰島素(5mg/L)、催乳素(5mg/L)、氫化可的松(1mg/L)的培養(yǎng)液進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，每隔6h收集一次上清液，經(jīng)1000r/min離心10～15min后，將上清液進(jìn)行濃縮，-20℃保存。上清液經(jīng)Westernblot檢測有目的蛋白表達(dá)，分子量為42ku。 5.篩選的陽性細(xì)胞作為供體細(xì)胞，電融合