膜聯(lián)蛋白A1在小鼠睪丸中的表達、定位及其與受精的關系.pdf

1、膜聯(lián)蛋白是一類鈣依賴性磷脂結合蛋白，形成進化上保守的多基因家族，在動、植物中廣泛表達。在細胞各種生理功能中起重要作用。膜聯(lián)蛋白A1(AnnexinA1，簡稱AnxA1)是哺乳動物膜聯(lián)蛋白家族中的一個重要成員，它與細胞增殖、分化、信號傳遞、炎癥等密切相關，前期研究已發(fā)現(xiàn)它在精子中亦有表達，并呈區(qū)域性分布，推測與精子的一系列鈣依賴事件如運動、頂體反應過程中的膜融合、受精過程中的精卵相互作用等有關。但目前它在生殖系統(tǒng)中的作用尚不明確，在睪丸中

2、的表達定位尚未見報道，對其在精子中的定位研究還相當有限，且還未見關于它在精子中功能的較為直接的研究。本文以小鼠為實驗對象，研究AnxA1在出生后不同發(fā)育時期睪丸中的表達與定位，以期了解它與睪丸出生后發(fā)育及精子發(fā)生的關系；同時，對處于不同成熟階段及不同生理功能狀態(tài)的精子進行AnxA1定位。此外，制備了AnxA1多克隆抗體并探討AnxA1與體外受精的關系。本研究旨在為闡明AnxA1在生殖系統(tǒng)中的作用奠定一定的基礎，可望為哺乳動物及人類受精機

3、制的研究提供一定的理論依據(jù)，從而為輔助生殖技術、不育癥診療與計劃生育提供一定的理論指導。本實驗分三部分。 1.膜聯(lián)蛋白A1在小鼠睪丸不同發(fā)育階段的表達與定位 對1～8周齡小鼠睪丸進行AnxA1間接免疫組化染色及半定量RT-PCR以研究AnxA1的表達水平及其定位。結果顯示：AnxA1在各級生精細胞中均有表達。其中精原細胞染色最強，主要分布在細胞核內(nèi)；初級精母細胞多為弱陽性或陰性；圓形精子細胞AnxA1分布在細胞一側頂

4、體泡、頂體帽中，精子的AnxA1分布在頂體中。精子形成后留下的殘余體亦呈強陽性染色。支持細胞未見明顯陽性染色。對1、2、3、4、5、6、8周齡小鼠睪丸AnxA1免疫組化染色陽性強度即平均積分光密度進行圖像分析結果分別是：2.94±0.36，8.53±0.90，7.32±1.22，6.87±0.51，5.59±0.53，4.53±0.38，4.64±0.40，單因素方差分析結果顯示1、2、5周齡組的AnxA1免疫組化染色強度與其余各組均存

5、在顯著性差異(P＜0.01)，3周齡與4周齡間(P=0.26，＞0.05)、6周齡與8周齡間(P=0.78，＞0.05)無顯著性差異，它們與其余組間存在顯著性差異(P＜0.01)。顯示AnxA1蛋白在1周齡小鼠睪丸中表達較低，2周齡后表達升高并達到峰值，而后逐漸下降，至6～8周趨于平穩(wěn)。對AnxA1mRNA進行半定量RT-PCR，以β-actin為內(nèi)參照，表達強度分別是：0.87±0.09，1.94±0.16，1.66±0.10，1.6

6、0±0.09，1.38±0.05，116±0.1，1.10±0.06，單因素方差分析結果顯示1、2、5周齡組的AnxA1mRNA水平與其余各組均存在顯著性差異(P＜0.01)，3周齡與4周齡間(P=0.36，＞0.05)、6周齡與8周齡間無顯著性差異(P=0.35，＞0.05)，它們與其余組間存在顯著性差異(P＜0.01)。結果表明AnxA1蛋白及mRNA在小鼠睪丸的表達水平出現(xiàn)加齡變化，其變化趨勢相似。提示AnxA1與小鼠生精細胞的增

7、殖分化以及睪丸出生后發(fā)育成熟有關。 2.膜聯(lián)蛋白A1在小鼠精子中的定位 用間接免疫熒光染色對取自小鼠生精管道中不同部位的精子以及處于不同生理狀態(tài)的精子進行AnxA1定位，以期了解AnxA1與精子睪丸后成熟、獲能、項體反應的關系。發(fā)現(xiàn)取自睪丸、附睪頭、體、尾部的精子AnxA1均分布于項體帽區(qū)及尾部，不同部位的精子AnxA1分布無明顯差別。對誘導獲能、頂體反應的精子進行AnxA1免疫熒光定位發(fā)現(xiàn)根據(jù)頭部熒光分布特點分為2

8、種類型：項體帽區(qū)標記型(Acrosomalcap)，簡稱“Cap"型；赤道段-頂體后區(qū)標記型(Equatorialsegment-postacrosomalarea，Ep)，簡稱“Ep"型。獲能培養(yǎng)組的精子"Cap"型百分率為97.3±1.04％，“Ep"型為2.7±1.04％；誘導項體反應組的精子"Cap"型百分率為41.8±4.09％，“Ep"型為58.2±4.09％。同時用考馬斯亮藍染色鑒定精子頂體反應率，發(fā)現(xiàn)獲能培養(yǎng)組頂體完整的

9、精子百分率為94.6±2.51％，頂體反應率為5.4±2.51％；誘導頂體反應組頂體完整的精子百分率為353±3.68％，項體反應率為64.7±3.68％。結果表明AnxAl熒光"Cap"型百分率與考馬斯亮藍染色鑒定的頂體完整的精子百分率相近，“Ep"型與項體反應的精子百分率相近。用膠體金間接免疫電鏡技術對誘導獲能、頂體反應的精子進行AnxAl定位發(fā)現(xiàn)，頂體反應初期精子膠體金標記主要表現(xiàn)為"Cap"型，而項體反應后期接近完成時主要表現(xiàn)為

10、“Ep”型，分布區(qū)域與免疫熒光定位結果類似。項體完整的精子未見膠體金標記。綜合光電鏡結果，提示獲能后精子AnxAl分布無明顯變化，仍分布于頂體帽區(qū)及尾部；而項體反應后的精子，AnxAl主要分布于赤道段及頂體后區(qū)。 3.膜聯(lián)蛋白A1與小鼠體外受精的關系 首先利用RT-PCR技術克隆了小鼠睪丸全長AnxAlcDNA，將其與表達載體pGEX-5T質(zhì)粒連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌并用0.8mmol/L的IPTG誘導其表達。利用GST親

11、和層析柱純化融合蛋白GST-AnxAl，并用凝血酶切除GST，將純AnxA1蛋白免疫家兔，獲得抗血清并初步純化免疫球蛋白，ELISA檢測AnxA1抗血清效價，Western-Blot檢測抗血清的特異性。結果顯示，RT-PCR產(chǎn)物電泳可見1041bp的片段，與預期片段長度一致，測序結果與小鼠AnxA1cDNA序列完全一致；融合蛋白GST-AnxA1在細菌中高效表達，蛋白產(chǎn)量約占菌體蛋白總量的30％，主要為可溶性形式。融合蛋白經(jīng)親和層析純化

12、后電泳可見63KD的條帶，與預期分子量相符，純度達90％以上；用凝血酶除去GST，電泳可見37KD的條帶，與預期AnxA1分子量相符。免疫家兔后用ELISA檢測AnxA1抗血清效價達1：47，Western-Blot檢測AnxA1抗血清特異性，發(fā)現(xiàn)AnxA1抗血清可特異結合重組AnxA1。同時研究了AnxA1多抗對小鼠體外受精的影響。用制備的兔抗小鼠AnxA1多抗處理獲能前及獲能后小鼠精子，并進行體外受精實驗，以陰性兔血清為對照，以受精

13、率為指標，研究AnxA1多抗對精子穿含透明帶卵及去透明帶卵有否影響。結果顯示AnxA1多抗處理獲能前精子，含透明帶卵受精率為67.47±9.14％，陰性對照組為64.39±7.99％；去透明帶卵受精率為85.48±5.51％，陰性對照組為87.67±4.71％。AnxA1多抗處理獲能后精子，含透明帶卵受精率為70.79±4.51％，陰性對照組為74.07±7.06；去透明帶卵受精率為86.09±3.94，陰性對照組為88.15±577。

14、方差分析結果顯示AnxA1多抗處理組與陰性對照組之間均無顯著性差異(P＞0.05)。表明AnxA1多抗對精子穿透含透明帶卵及去透明帶卵均無明顯影響。 結論: 1膜聯(lián)蛋白A1在小鼠睪丸中的表達具有時空變化規(guī)律，可能與小鼠生精細胞的增殖分化及睪丸出生后發(fā)育成熟有關。 2取自小鼠生精管道中不同部位的精子AnxA1均分布于項體帽區(qū)及尾部，不同部位的精子AnxA1分布無明顯差別。獲能后精子AnxA1分布無明顯變化，頂