TSP2-8CUB1+2片段影響流動(dòng)狀態(tài)下ADAMTS-13活性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討在流動(dòng)狀態(tài)下TSP2-8CUB1+2 片段是否影響ADAMTS13 裂解活性。
　　 方法：
　　 ⑴以人ADAMTS-13 cDNA 為模板，通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)擴(kuò)增缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS-13 cDNA；并重組于真核表達(dá)載體pcDNA3.1-V5-His，構(gòu)建重組質(zhì)粒。
　　 ⑵以脂質(zhì)體法將全長(zhǎng)和重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS7細(xì)胞，用Western blot法對(duì)目的蛋白質(zhì)的表達(dá)

2、進(jìn)行鑒定。
　　 ⑶用Western blot 方法檢測(cè)對(duì)比分析流動(dòng)狀態(tài)下全長(zhǎng)和重組蛋白的活性差異。
　　 結(jié)果：
　　 ⑴瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示PCR 擴(kuò)增出的特異片段約2163bp，DNA 測(cè)序結(jié)果與Genebank 報(bào)道的完全一致，成功構(gòu)建了重組質(zhì)粒ADAMTS-13(缺失TSP2-8 CUB1+2)-pcDNA3.1/V5-His-TOPO。
　　 ⑵收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的COS7細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)超濾管濃

3、縮后，進(jìn)行Western blot電泳分析，結(jié)果證實(shí)全長(zhǎng)和重組蛋白為細(xì)胞上清分泌性表達(dá)。
　　 ⑶在mini vortexer 誘導(dǎo)的剪切力條件下，缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS13蛋白活性較全長(zhǎng)ADAMTS13蛋白活性顯著下降。
　　 結(jié)論：
　　 ⑴成功構(gòu)建了缺失TSP2-8CUB1+2的ADAMTS-13重組質(zhì)粒，并表達(dá)了全長(zhǎng)和重組的ADAMTS13蛋白。
　　 ⑵初步證實(shí)：在流動(dòng)狀態(tài)下