TSP2-8CUB1+2片段影響ADAMTS-13分泌方向的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究TSP2-8CUB1+2片段是否決定血管性血友病因子裂解酶(ADAMTS13)合成后細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸?shù)姆较?，了解金屬蛋白酶ADAMTS13羧基端結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，為臨床了解和治療血栓性血小板減少性紫癜疾病提供理論依據(jù)。
　　 方法：采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)及DNA重組技術(shù)構(gòu)建pcDNA3.1-ADAMTS13及pcDNA3.1-delTSP2-8CUB1+2ADAMTS13重組質(zhì)粒；用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染犬腎上皮極性細(xì)

2、胞MDCK，篩選出陽性細(xì)胞克隆后傳代鋪到中間有特殊分子篩膜的雙池培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)，細(xì)胞生長到無空隙后收集上、下池培養(yǎng)液；通過Western Blot檢測上、下池培養(yǎng)液中ADAMTS13蛋白表達(dá)水平，以對(duì)比分析ADAMTS13蛋白在極性細(xì)胞內(nèi)的分泌方向。
　　 結(jié)果：
　　 1.經(jīng)PCR擴(kuò)增、酶切電泳分析和DNA測序證實(shí)，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的重組質(zhì)粒目的基因片段為人delTSP2-8CUB1+2ADAMTS13-cDNA。
　

3、　 2.穩(wěn)定表達(dá)野生型ADAMTS13的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于特殊分子篩膜上后，通過Western Blot僅在膜的上池培養(yǎng)液中檢測到ADAMTS13蛋白。
　　 3.穩(wěn)定表達(dá)缺失TSP2-8CUB1+2區(qū)域ADAMTS13的MDCK細(xì)胞培養(yǎng)于特殊分子篩膜上后，利用Western Blot在膜的上、下池培養(yǎng)液中均檢測到ADAMTS13重組蛋白。
　　 結(jié)論：
　　 1.金屬蛋白酶ADAMTS13的分泌是有極性