人鼻咽癌細(xì)胞系CNE2分泌蛋白質(zhì)譜的建立及EGFR調(diào)控的CNE2分泌蛋白質(zhì)的篩選.pdf

1、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一種由EGFR瘤基因編碼的170kDa跨膜的酪氨酸激酶受體，它具有刺激細(xì)胞生長、調(diào)節(jié)細(xì)胞分化及抑制細(xì)胞凋亡的作用。EGFR在多種腫瘤中高表達(dá)和/或異常活化，通過增加腫瘤細(xì)胞增殖、阻止其凋亡、增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲性，促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展。目前EGFR已成為腫瘤治療的重要分子靶標(biāo)。已有的研究表明，鼻咽癌(nasopharyngeal carinoma，

2、NPC)中存在著表皮生長因子受體的過表達(dá)，并與NPC的分級、分期密切相關(guān)。另外，EB病毒編碼的致瘤蛋白LMPl可上調(diào)NPC細(xì)胞 EGFR 及其配體EGF的表達(dá)，通過：EGF/EGFR自分泌環(huán)促進(jìn)NPC細(xì)胞生長。這些研究結(jié)果提示：EGFR在NPC的發(fā)生發(fā)展中具有重要的作用，但EGFR在NPC中的作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明。 分泌性蛋白是指分泌到細(xì)胞膜外的蛋白質(zhì)，包括血液和組織液中的生長因子、細(xì)胞因子、肽類激素、酶類等，約占人類蛋白質(zhì)

3、組的十分之一。分泌性蛋白質(zhì)扮演著細(xì)胞間信息傳遞的重要角色，以旁分泌、自分泌等方式發(fā)揮生理或病理作用。腫瘤細(xì)胞在生長增殖過程中與周圍環(huán)境不斷發(fā)生物質(zhì)交換，它們分泌的各種蛋白質(zhì)不僅是腫瘤細(xì)胞自身生長、侵襲和轉(zhuǎn)移所必需，而且這些蛋白質(zhì)自腫瘤細(xì)胞分泌后，部分可到達(dá)血液、淋巴液等體液中，可能是腫瘤診斷的分子標(biāo)志物。因此，識別、鑒定腫瘤細(xì)胞特異的分泌蛋白質(zhì)不僅有助于揭示腫瘤發(fā)病的分子機(jī)理，而且可發(fā)現(xiàn)腫瘤的分子標(biāo)志物，具有重要的理論與應(yīng)用價(jià)值。腫瘤是

4、一種多階段、多基因參與的復(fù)雜過程，其基因水平的變化必然導(dǎo)致大量分泌性蛋白質(zhì)的改變，然而由于方法的局限性，以往關(guān)于腫瘤分泌性蛋白質(zhì)的研究絕大多數(shù)是針對單一或某類蛋白質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，腫瘤分泌蛋白質(zhì)組學(xué)研究正在興起，如前列腺癌分泌蛋白質(zhì)組研究發(fā)現(xiàn)幾種受雄激素調(diào)控的蛋白質(zhì)與前列腺癌生長密切相關(guān)，可能是前列腺癌的潛在分子標(biāo)志物。 為了解NPC分泌蛋白質(zhì)組的組成，揭示EGFR在NPC發(fā)病中作用機(jī)制，本研究從分泌蛋白組的角

5、度出發(fā)，采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)分離鑒定NPC細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)，并篩選EGFR 調(diào)控的NPC細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)。本研究的思路如下：采用無血清培養(yǎng)法培養(yǎng)NPC細(xì)胞系CNE2細(xì)胞，采用EGFR配體轉(zhuǎn)化生長因子-α(TGF-α)刺激CNE2細(xì)胞24小時(shí)作為實(shí)驗(yàn)組，對照組CNE2細(xì)胞不用TGF-α刺激。實(shí)驗(yàn)組與對照組細(xì)胞的培養(yǎng)上清通過超濾法脫鹽并濃縮，制備實(shí)驗(yàn)組與對照組CNE2細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)，采用雙向凝膠電泳技術(shù)分離實(shí)驗(yàn)組與對照組CNE2細(xì)胞的分泌蛋白

6、質(zhì)，建立實(shí)驗(yàn)組與對照組CNE2細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)的2-DE圖譜。應(yīng)用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)技術(shù)鑒定對照組CNE2細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)，利用生物信息學(xué)資源對所鑒定的蛋白質(zhì)的功能和亞細(xì)胞定位進(jìn)行分析，建立CNE2細(xì)胞的分泌蛋白質(zhì)譜。再采用圖像分析軟件比較實(shí)驗(yàn)組與對照組CNE2細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)2-DE圖譜的差異，應(yīng)用MALDI-TOF-MS鑒定EGFR調(diào)控的CNE2分泌蛋白質(zhì)。本研究摸索出了一套有效的可用于蛋白質(zhì)組