MASP-2 CUB1和CUB2功能區(qū)蛋白抗體制備及初步鑒定.pdf

1、補體系統(tǒng)作為機體固有免疫防御的重要部分，是具有精密調(diào)控機制的蛋白質(zhì)反應系統(tǒng)。而甘露聚糖結(jié)合凝集素相關(guān)絲氨酸蛋白酶2(mannan-binding lectin associated serine protease-2，MASP-2)作為激活補體凝集素途徑的重要參與者，具有極為重要的生物學意義。MASP-2的缺乏或功能障礙可能導致長期性易發(fā)感染，與腫瘤和自身免疫性疾病的發(fā)生及發(fā)展也存在關(guān)聯(lián)。
　　機體在甘露聚糖結(jié)合凝集素（manno

2、se-binding lectin，MBL）識別并結(jié)合病原體后，激活補體凝集素途徑。此時MASP-2分子中絲氨酸蛋白酶區(qū)域的精氨酸-異亮氨酸間的肽鍵裂解并產(chǎn)生自激活作用，進而引發(fā)后續(xù)反應。MASP-2分子由6個功能區(qū)片段組成，CUB結(jié)構(gòu)域是在補體成分Clr/C1s、Uegf和骨髓多態(tài)形成蛋白(bone morphogenetic protein1，bmp1)中發(fā)現(xiàn)的結(jié)構(gòu)域。CUB1-EGF與MASP-2同源二聚體形成相關(guān)，CUB1-EG

3、F-CUB2與MBL結(jié)合相關(guān)，并決定其是否能夠被活化。本實驗擬在分別成功構(gòu)建CUB1及CUB2原核重組表達載體的基礎上，應用異丙基硫代半乳糖苷（Isopropy1-β-D-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導表達融合蛋白，經(jīng)純化后免疫適齡雌性BALB/c小鼠，制備高特異性的多克隆抗體，以期為后續(xù)檢測體液MASP-2含量、構(gòu)建以多克隆抗體為基礎的臨床輔助診斷乃至治療奠定基礎。
　　本實驗將CUB1及CUB2基因

4、片段通過PCR技術(shù)擴增所獲得的產(chǎn)物經(jīng)純化后以BamHⅠ、NotⅠ進行雙酶切，繼而切膠回收，經(jīng)DNA連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-6P-2-CUB1及pGEX-6P-2-CUB2，分別將攜帶CUB1、CUB2基因片段的pGEX-6P-2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入E.coli BL21感受態(tài)細胞，并將菌液涂布于LB選擇性固體培養(yǎng)基上篩選陽性克隆，獲得的陽性克隆經(jīng)過驗證后取單一菌落接種于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)14～16小時。擴大培養(yǎng)至A600于0.8～1

5、.0之間，加入IPTG誘導蛋白表達。離心后棄除上清液并充分洗滌菌體沉淀后，在冰浴條件下進行超聲裂解，分別取裂解后上清液和沉淀制備樣本進行SDS-PAGE，分析融合蛋白所在組分。GST-CUB1及GST-CUB2蛋白均以包涵體形式存在，利用高濃度尿素變性，梯度復性后純化融合蛋白。
　　將純化后的融合蛋白作為抗原，與Freund佐劑充分混合后免疫5周齡BALB/c雌性小鼠，此后分別于第1天、第14天及第28天進行腹腔免疫注射，于末次免