miR-593-5p對(duì)胃癌裸鼠移植瘤的影響及其相關(guān)作用機(jī)制.pdf

1、目的：觀察miR-593-5p在人胃癌MGC-803細(xì)胞中上調(diào)后對(duì)裸鼠移植瘤模型胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)，侵襲、轉(zhuǎn)移的影響，并探討其可能的分子作用機(jī)制。
　　方法：置人胃癌MGC-803細(xì)胞于10％胎牛血清的培養(yǎng)液里，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱里常規(guī)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，收集人胃癌MGC-803細(xì)胞，接種于六孔板中，并分為3組，按照慢病毒轉(zhuǎn)染說明書操作，將重組慢病毒顆粒（Lv-hsa-miR-593-5p-gfp）感染的人胃癌M

2、GC-803細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組（experimental group），慢病毒空載體顆粒（Lv-gfp）感染的人胃癌MGC-803細(xì)胞作為陰性對(duì)照組（negative control group），不做任何處理的人胃癌MGC-803細(xì)胞作為空白對(duì)照組(blank control group)。感染完成后，使用嘌呤霉素篩選轉(zhuǎn)染病毒的細(xì)胞，使其成為穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株。運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞miR-593-5p的基因表達(dá)量。收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的各組

3、細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞量為1×106個(gè)/ml，分別將各組細(xì)胞接種于裸鼠左上肢腋窩下，每只裸鼠200ul，每組10只。正常飼養(yǎng)，每天觀察各裸鼠的精神，營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，每4天測(cè)量一次移植瘤體積大小。20天后處死所有裸鼠，取裸鼠移植瘤、肝、肺組織浸泡于福爾馬林中，并做蠟塊。取裸鼠移植瘤組織，肝、肺組織做HE染色，觀察其組織的病理改變。并取各組裸鼠移植瘤組織，應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測(cè)方法，檢測(cè)各組裸鼠組織切片CD44的蛋白表達(dá)。將成功上調(diào)miR-593-5p的人

4、胃癌MGC-803細(xì)胞實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組應(yīng)用基因芯片實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，得到差異表達(dá)的基因。應(yīng)用在線生物信息學(xué)預(yù)測(cè)軟件Targetscan，miRDB和microRNA.org預(yù)測(cè)miR-593-5p的直接下游靶基因。結(jié)合兩者結(jié)果篩選出可能的下游靶基因?yàn)镸ST4，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞MST4的基因表達(dá)量，運(yùn)用western blot檢測(cè)各組細(xì)胞MST4的蛋白表達(dá)量，使用雙熒光素酶報(bào)告基因驗(yàn)證擬定靶基因MST4。
　　結(jié)果：重組

5、慢病毒感染人胃癌MGC-803細(xì)胞且實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組miR-593-5p明顯上調(diào)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)裸鼠移植瘤模型，實(shí)驗(yàn)組移植瘤RTV的增長(zhǎng)速率較陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組緩慢。第20天移植瘤體積大小，實(shí)驗(yàn)組明顯小于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組。HE染色病理學(xué)觀察各組移植瘤組織，確認(rèn)所取瘤組織為惡性腫瘤組織。實(shí)驗(yàn)組觀察到肝、肺組織中的惡性腫瘤組織轉(zhuǎn)移灶明顯較其他兩組少，出現(xiàn)惡性腫瘤轉(zhuǎn)移灶的裸鼠數(shù)量也較其他兩組少。免疫組織化學(xué)檢測(cè)示實(shí)驗(yàn)組瘤組織

6、中血管生成的數(shù)量較其他兩組少，CD44蛋白的表達(dá)量也較其他兩組少。深入研究miR-593-5p可能作用的分子機(jī)制，上調(diào)細(xì)胞miR-593-5p后的基因芯片結(jié)果示，受影響上調(diào)的基因共212個(gè)，下調(diào)的基因共263個(gè)，Targetscan，miRDB和microRNA.org三個(gè)在線預(yù)測(cè)軟件篩選可能的目的靶基因，綜合二者結(jié)果分析，得到可能的目的基因?yàn)镸ST4，TMEM135，TWSG1等7個(gè)基因，擬定MST4為基因miR-593-5p直接下游

7、靶基因。實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot分別檢測(cè)各組細(xì)胞MST4的mRNA和蛋白表達(dá)量，結(jié)果示實(shí)驗(yàn)組MST4的mRNA和蛋白表達(dá)量下調(diào)。雙熒光素酶基因報(bào)告系統(tǒng)示MST4與miR-593-5p不能直接結(jié)合。
　　結(jié)論：體內(nèi)裸鼠移植瘤模型，基因miR-593-5p的上調(diào)，致使裸鼠移植瘤的血管生成減少；人胃癌MGC-803細(xì)胞中基因miR-593-5p的過表達(dá)可下調(diào)MST4的mRNA和蛋白表達(dá)，miR-593-5p可能不直接