靶向抑制miRNA-21對(duì)K562細(xì)胞增殖及PTEN-P13K-AKT通路的影響.pdf

1、目的:MiRNA是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)約19-25個(gè)核苷酸的非編碼小RNA，表達(dá)具有明顯的組織特異性，且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以調(diào)控造血細(xì)胞生成，并改變細(xì)胞增殖、分化及凋亡。MiRNA-21是miRNA家族中的重要成員之一，通過(guò)調(diào)控靶基因及下游信號(hào)通路，調(diào)控腫瘤發(fā)生。已知抑癌基因10號(hào)染色體上缺失的磷酸酶與張力蛋白同源物PTEN為miRNA-21的靶基因之一，具有抑癌活性，且PTEN可以負(fù)調(diào)控PI3K/AKT通路活性，

2、從而抑制血管新生并降低腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲。在白血病的發(fā)生發(fā)展中，PTEN-PI3K/AKT通路起到了重要作用。
　　白血病是一種起源于骨髓多能干細(xì)胞的惡性克隆增生性疾病。其主要表現(xiàn)為細(xì)胞惡性增殖、分化障礙、凋亡受阻等，使腫瘤細(xì)胞在骨髓及其他造血系統(tǒng)堆積，并可以浸潤(rùn)其他組織及器官，影響正常造血功能。隨著近年來(lái)對(duì)白血病發(fā)病機(jī)制的不斷研究，越來(lái)越多的腫瘤信號(hào)通路被發(fā)現(xiàn)，其中以PI3K/AKT介導(dǎo)的信號(hào)通路成為白血病發(fā)病及治療的研究熱點(diǎn)

3、。
　　本實(shí)驗(yàn)旨在K562細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miRNA-21抑制物inhibitor，通過(guò)MTT和流式細(xì)胞儀技術(shù)分析miRNA-21下調(diào)后對(duì)K562細(xì)胞增殖及早期凋亡的影響;并檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后PTEN-PI3K/AKT通路相關(guān)基因表達(dá)變化，進(jìn)一步通過(guò)Western blot檢測(cè)miRNA-21與PTEN蛋白表達(dá)的相關(guān)性。
　　方怯:體外培養(yǎng)K562細(xì)胞，將細(xì)胞分為4組，分別為:空白組、轉(zhuǎn)染組、隨機(jī)序列對(duì)照組、熒光素對(duì)照組。通過(guò)電轉(zhuǎn)染，

4、將化學(xué)合成的miRNA-21 inhibitor轉(zhuǎn)染對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的K562細(xì)胞，通過(guò)熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染率，MTT及流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡盼變化，RT-PCR及Western-blot檢測(cè)PTEN-PI3K/AKT通路表達(dá)變化。
　　結(jié)果:
　　1、RT-PCR方法檢測(cè)miRNA-21 inhibitor在K562細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)染效率RT-PCR結(jié)果顯示，miRNA-21 inhibitor轉(zhuǎn)染K562

5、細(xì)胞后miRNA-21在轉(zhuǎn)染組、隨機(jī)序列對(duì)照組及熒光素對(duì)照組相對(duì)空白組表達(dá)比例分別為（8.070±5.138）％、(91.600±2.452)％、(92.247±2.053)％,轉(zhuǎn)染組miRNA-21表達(dá)較其他三組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　2、MiRNA-21 inhibitor封閉miRNA-21表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞增殖的影響
　　在轉(zhuǎn)染12h、24h、36h、48h、60h后，應(yīng)用MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

6、抑制率，相對(duì)于空白組細(xì)胞，不同時(shí)間段轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率分別為（2.6±0.4）％、（8.1±1.0）％、(15.5±1.4)％、（29.1±2.2）％、（43.1±3.1）％，隨機(jī)序列對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率分別為（3.6±0.5）％、（7.6±0.9）％、（4.6±0.7）％、（4.3±0.6）％、（3±0.5）％，熒光素對(duì)照組細(xì)胞增殖抑制率分別為（2.9±0.3）％、（2.8±0.4）％、（5.6±1.0）％、（4.1±0.6）％、（

7、5.7±0.9）％。轉(zhuǎn)染組K562細(xì)胞增殖明顯減慢，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3、MiRNA-21 inhibitor封閉miRNA-21表達(dá)對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響
　　流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染48h后空白組、轉(zhuǎn)染組、隨機(jī)序列對(duì)照組及熒光素對(duì)照組細(xì)胞凋亡率分別為（2.334±0.263）％、（13.370±0.250）％、（3.990±0.436）％、(2.894±0.352)％，轉(zhuǎn)染組中凋亡細(xì)胞百分比顯著高

8、于其他三組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4、抑制miRNA-21后K562細(xì)胞PTEN基因表達(dá)變化
　　PTEN蛋白在空白組、轉(zhuǎn)染組、隨機(jī)序列對(duì)照組及熒光素對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為(4.911±0.450)、（14.701±0.810）、(4.733±0.524)和（4.271±0.682），轉(zhuǎn)染組PTEN蛋白表達(dá)較其他三組明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5、抑制miRNA-21后K562

9、細(xì)胞PI3K蛋白表達(dá)變化
　　PI3K蛋白在空白組、轉(zhuǎn)染組、隨機(jī)序列對(duì)照組及熒光素對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為（3.343±0.201）、（1.015±0.122）、（3.220±0.111）和（3.439±0.098），轉(zhuǎn)染組PI3K蛋白表達(dá)較其他三組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6、抑制miRNA-21后K562細(xì)胞磷酸化AKT(p-AKT)基因表達(dá)變化
　　P-AKT蛋白在空白組、轉(zhuǎn)染組、隨機(jī)序列

10、對(duì)照組及熒光素對(duì)照組的相對(duì)表達(dá)量分別為（3.040±0.094）、(0.463±0.080)、（3.628±0.103）和（3.447±0.139），轉(zhuǎn)染組p-AKT蛋白表達(dá)較其他三組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1、抑制miRNA-21表達(dá)誘導(dǎo)K562細(xì)胞早期凋亡，抑制K562細(xì)胞增殖。
　　2、抑制miRNA-21可以通過(guò)上調(diào)PTEN表達(dá)而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而發(fā)揮其抗細(xì)