鑭對LPS激活血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB-Jmjd3信號軸下游基因表達(dá)的表觀遺傳學(xué)調(diào)控.pdf

1、目的:
　　本研究以內(nèi)毒素(LPS)激活人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)釋放炎癥因子為模型，探索氯化鑭(LaCl3)對血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB-Jmjd3信號軸的影響，并分析其可能的表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，為有效抑制血管炎癥反應(yīng)，開發(fā)稀土藥用價值提供實驗依據(jù)。
　　方法:
　　1、細(xì)胞培養(yǎng)及分組:復(fù)蘇并常規(guī)培養(yǎng)原代HUVECs，將處于對數(shù)生長期的HUVECs隨機(jī)分為空白對照組（control:給予無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2h）、LP

2、S組(以含1μg/ml LPS的無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)2h)、LaCl3組(以含2.5μM/ml LaCl3無血清培養(yǎng)基孵育細(xì)胞2h)及LPS+LaCl3組(以含2.5μM/ml LaCl3無血清培養(yǎng)基預(yù)處理細(xì)胞30min后，更換含1μg/ml LPS無血清培養(yǎng)基繼續(xù)作用細(xì)胞2h)。
　　2、MTT法檢測LaCl3對HUVECs細(xì)胞活力的影響。
　　3、分離HUVECs胞漿及胞核蛋白，蛋白質(zhì)印跡法檢測NF-κB信號系統(tǒng)相關(guān)蛋白表達(dá)

3、水平。
　　4、Millipore轉(zhuǎn)錄因子試劑盒檢測胞核提取物中NF-κB/p65蛋白與靶序列的結(jié)合活性。
　　5、采用實時定量PCR及蛋白質(zhì)印跡法從mRNA及蛋白質(zhì)水平檢測HUVECs中Jmjd3的表達(dá)量。
　　6、應(yīng)用Millipore染色質(zhì)免疫共沉淀試劑盒建立NF-κB/p65、Jmjd3及H3K27me3關(guān)聯(lián)的DNA文庫，結(jié)合實時定量PCR分析在目標(biāo)基因TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-1β、COX-2及

4、ICAM-1轉(zhuǎn)錄起始結(jié)合位點(diǎn)NF-κB/p65、Jmjd3、H3K27me3的富集變化。
　　7、采用實時定量PCR法及ELISA試劑盒分別檢測細(xì)胞中TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-1β及ICAM-1炎性基因的表達(dá)水平及其在細(xì)胞上清液中濃度的變化。
　　結(jié)果:
　　1、LaCl3對HUVECs活力的影響:與對照組比較，當(dāng)LaCl3濃度為2.5、5.0、25、50、100μmol/L時HUVECs的生長情況無明顯

5、差異，當(dāng)作用濃度為200μmol時，HUVECs的生長出現(xiàn)抑制現(xiàn)象(與對照組相比P＜0.05)，實驗濃度(2.5μmol/L)的LaCl3對HUVECs未體現(xiàn)出毒性作用。
　　2、LaCl3抑制LPS誘導(dǎo)HUVECs NF-κB-Jmjd3表達(dá)上調(diào):(1)Western-Blot結(jié)果示，與對照組相比，LPS組胞核NF-κB/p65表達(dá)水平明顯升高，而LPS+ LaCl3組則顯著下調(diào)，LaCl3組NF-κB/p65表達(dá)水平變化不明顯

6、;IκBα的表達(dá)量在對照組為最高，其次是LaCl3組，表達(dá)略有下調(diào)，而在LPS組則出現(xiàn)顯著下調(diào)，IκBα的表達(dá)量在LPS+LaCl3組則低于LaCl3組，但與LPS組相比無明顯變化。(2)Jmjd3的表達(dá)與活性:RT-qPCR與Western-Blot結(jié)果基本一致，相對于對照組，LPS組Jmjd3基因表達(dá)水平提高，LPS+LaCl3組則顯著下降，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，而LaCl3組無明顯差異。
　　3、LaCl3對H

7、UVECs中NF-κB/p65與其下游靶序列結(jié)合活性的影響:LPS作用于HUVECs后，NF-κB/p65結(jié)合DNA的活性顯著高于對照組(P＜0.01)，而LPS+LaCl3組顯著低于LPS組(P＜0.01)，LaCl3組與對照組相比則變化不顯著。
　　4、NF-κB/p65與炎性基因啟動子結(jié)合水平分析:NF-κB/p65關(guān)聯(lián)的DNA文庫結(jié)合實時定量PCR分析提示:(1) LPS組:NF-κB/p65在TNF-α、MMP-9、IL

8、-6、IL-1β、COX-2及ICAM-1基因啟動子區(qū)的募集量明顯高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(2) LPS+LaCl3組:NF-κB/p65在上述基因啟動子區(qū)的募集量均明顯低于LPS組(P＜0.05);與對照組相比，NF-κB/p65在TNF-α、IL-6、IL-1β及ICAM-1基因啟動子區(qū)的募集量明顯下降(P＜0.05)，而在MMP-9及COX-2基因啟動子區(qū)的募集量無明顯變化。(3) LaCl3組:與對照組

9、相比，NF-κB/p65在TNF-α、ICAM-1基因啟動子區(qū)的募集量明顯升高(P＜0.05)，而在IL-6、IL-1β、及COX-2基因啟動子區(qū)的募集量無顯著差異，在MMP-9基因啟動子區(qū)的募集量則顯著下降(P＜0.05);可見LaCl3可以抑制阻斷LPS誘導(dǎo)的NF-κB/p65在促炎基因啟動子區(qū)的富集，而單獨(dú)使用LaCl3作用細(xì)胞，胞內(nèi)NF-κB/p65在促炎基因啟動子區(qū)富集的調(diào)控則存在多樣性，使其募集量在TNF-α及ICAM-1基

10、因啟動子區(qū)明顯升高，在IL-6、IL-1β及COX-2基因啟動子區(qū)無明顯變化，而在MMP-9基因啟動子區(qū)的募集量則顯著下降。
　　5、Jmjd3與炎性基因啟動子結(jié)合水平分析:Jmjd3關(guān)聯(lián)的DNA文庫結(jié)合實時定量PCR分析提示:(1)與對照組相比，LPS組及LaCl3組Jmjd3在上述基因啟動子區(qū)的募集量均顯著升高(P＜0.05);(2) LPS+LaCl3組:Jmjd3在上述基因啟動子區(qū)的募集量要明顯低于LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)

11、意義(P＜0.05);與對照組相比，Jmjd3在IL-1β及COX-2基因啟動子區(qū)的募集量明顯下降，在IL-10及ICAM-1基因啟動子區(qū)的募集量明顯升高，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，而在TNF-α、MMP-9及IL-6基因啟動子區(qū)的募集量無明顯變化。表明LaCl3可以抑制LPS誘導(dǎo)的Jmjd3在TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-1β、COX-2及ICAM-1基因啟動子區(qū)的富集，而單獨(dú)使用LaCl3孵育HUVECs發(fā)現(xiàn)Jmjd

12、3在促炎基因啟動子區(qū)的募集量均顯著升高。
　　6、炎性基因啟動子區(qū)H3K27me3甲基化水平分析:H3K27me3關(guān)聯(lián)的DNA文庫結(jié)合實時定量PCR分析提示:(1) LPS組:H3K27me3在上述基因啟動子區(qū)的水平明顯低于control組(P＜0.05);(2) LPS+LaCl3組:在上述所有基因啟動子區(qū)的水平要明顯高于LPS組，但同時低于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05);(2) LaCl3組:與對照組相比，H3K

13、27me3在TNF-α、IL-6、COX-2及ICAM-1基因啟動子區(qū)的水平明顯升高(P＜0.05)，在MMP-9基因啟動子區(qū)的水平明顯低于對照組(P＜0.05)，而在IL-1β基因啟動子區(qū)的水平無明顯變化?？梢奓aCl3可以抑制上述炎性基因啟動子區(qū)的H3K27me3去甲基化，單獨(dú)使用LaCl3處理HUVECs，H3K27me3的水平在TNF-α、IL-6、COX-2及ICAM-1基因啟動子區(qū)升高，在MMP-9基因啟動子區(qū)則下降，在IL

14、-1β基因啟動子區(qū)則無明顯變化。
　　7、LaCl3抑制LPS誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞炎性介質(zhì)的表達(dá)與釋放:RT-qPCR及ELISA（酶聯(lián)免疫吸附法）分別在mRNA及蛋白水平顯示，與對照組相比，TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1及MMP-9在LPS組表達(dá)量顯著增多，LaCl3組無顯著變化，而在LPS+LaCl3組，上述炎性介質(zhì)的表達(dá)與釋放明顯低于LPS組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。表明LaCl3可以有效抑制LPS引起

15、的TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-1β及ICAM-1的分泌。
　　結(jié)論:
　　1、LPS通過誘導(dǎo)HUVECs中NF-κB/p65的活化并使其轉(zhuǎn)位入核進(jìn)而上調(diào)Jmjd3的表達(dá)。 Jmjd3入核作用于炎性基因啟動子區(qū)的H3K27me3使其去甲基化，暴露目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄起始序列，并促進(jìn)NF-κB/p65及Jmjd3在促炎基因啟動子區(qū)富集，三者相互協(xié)同，激活炎性基因TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-1β、COX-2及ICA

16、M-1的表達(dá)。
　　2、LaCl3通過阻斷LPS誘導(dǎo)的HUVECs中NF-κB/p65的活化及核轉(zhuǎn)位，抑制Jmjd3的表達(dá)上調(diào)。減少LPS誘導(dǎo)的NF-κB/p65及Jmjd3在促炎基因啟動子區(qū)的富集，并抑制促炎基因啟動子區(qū)H3K27me3的去甲基化，使炎性基因保持沉默狀態(tài)，從而抑制LPS誘導(dǎo)的HUVECs分泌炎性因子TNF-α、MMP-9、IL-6、IL-1β及ICAM-1。
　　3、在本研究中作為對照的LaCl3組中，筆者