從NF-κB-Jmjd3信號軸下游基因表達的表觀調控角度分析衰老血清損傷人血管內皮細胞功能的研究.pdf

1、目的：
　　通過將老年人血清作用臍靜脈血管內皮細胞后，觀察衰老機體血清對血管內皮細胞生物學活性的影響；研究衰老機體血清對內皮細胞的炎性介質分泌的作用；了解調控內皮細胞炎性介質的NF-κB-Jmjd3信號通路的活化情況，分析其可能的表觀遺傳學調控機制。期望對與衰老相關性疾病的診斷及治療提供新思路和新靶點。
　　方法：
　　1、研究對象的選擇及分組：
　　青年組：20~30歲健康體檢者16例，平均年齡（25.60±1

2、.97）歲；老年組：60~70歲健康體檢者16例，平均年齡（66.60±4.78）歲；高齡老年組16例：80歲以上健康老年人，平均年齡（85.86±5.79）歲。
　　取清晨空腹靜脈血5ml，離心后分離血清分裝后放入-80℃冰箱冷凍待用。實驗時，將冷凍收集好的血清按健康青年組（25y）、健康老年組（65y）、健康高齡老年組（85y）分別混合制成3個標本池。
　　2、臍靜脈血管內皮細胞（HUVECs）的分離、培養(yǎng)、復蘇、傳代、

3、鑒定：取傳代至3~5代的細胞于對數(shù)生長期進行實驗，隨機分組為25y，65y和85y組，分別以健康青年組、健康老年組和健康高齡老年樣本池中的血清配成條件培養(yǎng)基作用HUVECs細胞；根據(jù)檢測需要分別在不同時間點收集細胞和血清樣本，進行相應的測定，每個實驗重復3次。
　　3、細胞活性分析：采用CCK8法檢測各組血清處理對HUVECs活性的影響。
　　4、細胞衰老情況分析：β-半乳糖苷酶染色試劑盒計數(shù)各組內皮細胞中衰老細胞的數(shù)量。<

4、br>　　5、細胞周期分析：采用流式細胞術分析各組血清誘導對HUVECs細胞周期的影響。
　　6、活性氧水平分析：采用 DCFH-DA探針法，運用流式細胞術檢測內皮細胞的氧化應激水平。
　　7、血管內皮細胞的修復能力分析：各研究組血清誘導HUVECs后，用劃痕實驗檢測各組內皮細胞劃痕后的修復能力。
　　8、液相芯片技術分析血清池中炎性介質蛋白的水平。
　　9、血管內皮細胞炎癥反應和功能效應分子表達水平：運用熒光實

5、時定量PCR( qRT-PCR)測定內皮細胞炎性介質和粘附分子的表達（IL-1β, IL-6, TNF-а, IL-12, TGF-β, VCAM, ICAM, eNOS）。
　　10、血管內皮細胞內調控上述炎性介質和粘附分子表達的NF-κB/p65-Jmjd3信號通路活性分析：采用免疫熒光染色技術觀察各組血清誘導HUVECs后，內皮細胞內的NF-κB/p65核表達變化，Jmjd3的表達變化，組蛋白H3K27中賴氨酸甲基化水平的變

6、化。
　　結果：
　　1、不同血清處理HUVECs后，細胞活性的改變情況：與青年組(25y)相比，老年組(65y)、高齡老年組（85y）血清誘導后的均出現(xiàn)了生長抑制現(xiàn)象，差異有統(tǒng)計學意義，分別為P＜0.05、P＜0.01。
　　2、血清誘導細胞衰老情況：與青年組相比，老年組血清誘導HUVECs后， HUVECs中β-半乳糖苷酶染色陽性細胞數(shù)顯著增加、P＜0.05；與青年組相比，高齡老年組血清誘導的HUVECs中β-半乳

7、糖苷酶染色陽性細胞數(shù)亦顯著增多、P＜0.0001。
　　3、各組血清處理對HUVECs周期的影響：與25y組相比，65y組S期細胞百分數(shù)減少，而85y組S期細胞數(shù)增多，推測隨著年齡的增加，血清誘導內皮細胞的細胞周期紊亂，老年組S期細胞減少而高齡老年組S期細胞百分比異常增高。
　　4、不同血清誘導HUVECs氧化應激情況的分析：65y組內皮細胞探針的平均熒光強度較25y組顯著增高， P＜0.0001；85y的平均熒光強度亦顯著

8、增高，與25y相比， P＜0.0001。
　　5、血清對HUVECs的修復能力的影響：經過24小時觀察，65y和85y組HUVECs均展現(xiàn)出明顯降低的遷移修復能力。
　　6、血管內皮細胞內調控上述炎性介質和粘附分子表達的NF-κB/p65-Jmjd3信號通路活性：各研究組血清誘導HUVECs2小時后，與青年組(25y)相比，老年組(65y)及高齡老年組（85y）整體熒光強度逐漸增強，NF-κB/p65表達上調、并逐漸向轉胞核

9、內聚集；Jmjd3整體熒光強度逐漸增強，表達上調；內皮細胞內H3K27me3表達下調、整體熒光強度逐漸減弱；內皮細胞內H3K27me2表達上調、整體熒光強度逐漸增強。
　　7、各組血清池中炎性介質蛋白水平：與青年組(25y)相比，老年組(65y) TNF-α、IL-12、IL-6、IL-1β蛋白水平高表達，高齡老年組(85y)上述炎性介質低水平表達。
　　8、血管內皮細胞炎癥反應和功能效應分子表達：各組血清誘導HUVECs2

10、4小時后，與青年組(25y)相比，老年組(65y) TNF-α、白介素-12（IL-12）、VCAM-1基因mRNA的表達水平顯著上調，P＜0.01、P＜0.001、P＜0.001；eNOS表達水平明顯下調，P＜0.001；IL-6、IL-1β基因mRNA的表達水平顯著下調，P＜0.0001、P＜0.0001；高齡老年組(85y) IL-6、IL-1β、TGF-β、eNOS基因mRNA的表達水平顯著下調，P＜0.0001、P＜0.000

11、1、P＜0.005、P＜0.0001。
　　結論：
　　隨著年齡增加，衰老機體血清抑制血管內皮細胞活性，并顯著促進內皮細胞衰老；導致內皮細胞周期紊亂；阻礙內皮細胞傷口的修復能力；同時，HUVECs的氧化應激反應明顯增強；HUVECs的炎性介質及粘附分子的基因表達水平出現(xiàn)異常，這些現(xiàn)象伴隨NF-κB/p65-Jmjd3信號通路的異?；罨虷3K27甲基化水平的下調。NF-κB/p65-Jmjd3信號通路參與了衰老機體血清誘導內