不依賴于NF-κB信號(hào)通路的細(xì)胞因子破壞血管內(nèi)皮屏障功能.pdf

1、一、研究背景
　　 慢性炎癥的發(fā)生發(fā)展是通過(guò)不斷的釋放失去調(diào)節(jié)的細(xì)胞因子、大量募集炎性細(xì)胞以及增加血管通透性造成組織器官的損傷。在這一過(guò)程中，血管內(nèi)皮細(xì)胞的粘附和結(jié)構(gòu)屏障功能變化起到了關(guān)鍵作用。
　　 研究證實(shí)，炎性細(xì)胞因子如白介素1β(IL-1β)在體內(nèi)可以引起循環(huán)中的白細(xì)胞遷出并在損傷組織間隙聚集。目前已知該反應(yīng)中，白介素1β可通過(guò)與胞膜上受體結(jié)合激活髓細(xì)胞樣分化蛋白88(MyD88)介導(dǎo)的核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB

2、)依賴的信號(hào)通路，促進(jìn)白細(xì)胞的粘附、變形和遷出。然而對(duì)于白介素1β導(dǎo)致血管屏障功能的損傷，增加血管的通透性，其具體是否也依賴于NF-κB通路的激活，目前仍不得而知。
　　 血管內(nèi)皮在循環(huán)系統(tǒng)和周?chē)M織間產(chǎn)生結(jié)構(gòu)型屏障，調(diào)控血管中血漿成分和血細(xì)胞的向周?chē)M織滲漏。血管的通透性由兩種途徑調(diào)節(jié)：一種是經(jīng)細(xì)胞通透途徑；另一種是細(xì)胞旁通透途徑。在炎癥反應(yīng)時(shí)，細(xì)胞旁通透途徑對(duì)于血管內(nèi)皮通透性的調(diào)節(jié)尤為重要。細(xì)胞旁通透途徑主要由內(nèi)皮細(xì)胞間連接

3、調(diào)控，通過(guò)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的觀察發(fā)現(xiàn)，粘附連接是血管內(nèi)皮細(xì)胞間的主要連接形式。而構(gòu)成內(nèi)皮間粘附連接的主要分子是血管內(nèi)皮鈣黏蛋白(VE-cadherin)。它是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性鈣黏蛋白，其結(jié)構(gòu)和分布對(duì)于維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的生理功能起著重要的作用。
　　 ADP核基環(huán)化因子6(Arf6)是ras超家族中的一個(gè)小分子GTP結(jié)合蛋白，屬于ARF亞家族成員，分子量?jī)H20kD左右，在真核生物細(xì)胞中廣泛表達(dá)并且序列及其保守。目前研究發(fā)現(xiàn)AR

4、F6主要參與調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)膜運(yùn)輸和胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白裝配而涉及到多種生理功能，包括囊泡內(nèi)吞、分泌、膜出芽、胞質(zhì)分裂、吞噬、細(xì)胞粘連、細(xì)胞遷移等。
　　 Arf6的活化受到GTP酶激活蛋白(GAPs)和鳥(niǎo)苷交換因子(GEFs)的共同調(diào)節(jié)。Arf-GAPs是負(fù)調(diào)節(jié)因子，能催化與Arf6結(jié)合的GTP水解成GDP而抑制它的活性，而Arf-GEFs是正調(diào)節(jié)因子，能促進(jìn)ARF6-GDP向ARF6-GTP的轉(zhuǎn)換從而激活A(yù)rf6。
　　 在我們之

5、前的研究中發(fā)現(xiàn)Arf6的活化程度與血管內(nèi)皮的屏障功能有密切聯(lián)系：阻斷Arf6激活可以穩(wěn)定血管內(nèi)皮，激活A(yù)rf6可以增加新生血管的發(fā)生以及血管內(nèi)皮通透性。
　　 探尋炎癥發(fā)生時(shí)血管內(nèi)皮通透性改變的機(jī)制，研究炎性細(xì)胞因子IL-1β對(duì)于血管內(nèi)皮細(xì)胞影響的具體通路，都可以為存在炎癥反應(yīng)的疾病治療提供解決的靶點(diǎn)提示。
　　 二、研究目的
　　 本課題擬研究白介素-1β通過(guò)何種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響血管內(nèi)皮通透性；Arf6與VE-

6、cadherin之間的關(guān)系，如何通過(guò)調(diào)控Arf6來(lái)影響VE-cadherin的表達(dá)分布，協(xié)調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞間連接穩(wěn)定性；尋找IL-1β、Arf6以及VE-cadherin相互之間是否有聯(lián)系；并選取慢性炎癥的動(dòng)物模型(CIA)驗(yàn)證體外實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。
　　 三、材料和方法
　　 購(gòu)買(mǎi)HMVECs原代并進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增，第5代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。GTP-Arf6pulldown實(shí)驗(yàn)檢測(cè)全細(xì)胞裂解液中Arf6GTP形式的含量。單細(xì)胞層的電阻用EC

7、IS系統(tǒng)(AppliedBiophysics)檢測(cè)，數(shù)據(jù)單位為歐姆。利用Transwell系統(tǒng)檢測(cè)單細(xì)胞層對(duì)辣根過(guò)氧化物酶的滲透量。細(xì)胞免疫熒光染色、細(xì)胞膜組分分離以及Western免疫印記等方法檢測(cè)HMVECs細(xì)胞膜上VE-cadherin的量及分布形態(tài)。
　　 購(gòu)買(mǎi)帶有Arf6-Q67L基因片段或綠色熒光蛋白的腺病毒載體，按照適當(dāng)濃度感染HMVECs，感染48小時(shí)后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。購(gòu)買(mǎi)目的基因的siRNA溶解分裝后，以Hiperf

8、ect轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行兩次基因干擾，第二次干擾后48小時(shí)用實(shí)驗(yàn)。
　　 利用PCR、酶切、連接、轉(zhuǎn)化、篩選、測(cè)序以及擴(kuò)繒培養(yǎng)、質(zhì)粒抽提等方法構(gòu)建并獲得大量MyD88和ARNO的全長(zhǎng)及功能片段載體，以脂質(zhì)體將目的片段轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48小時(shí)后進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)。
　　 牛Ⅱ型膠原蛋白溶液與完全弗氏佐劑注射DBA/1J小鼠，21天后與不完全弗氏佐劑再次注射得到膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型。利用關(guān)節(jié)炎指數(shù)進(jìn)行評(píng)分分組，經(jīng)過(guò)D

9、MSO、SecinH3以及Enbrel(R)處理后，進(jìn)行組織學(xué)檢查。
　　 四、結(jié)果
　　 1.IL-1β誘導(dǎo)血管通透性的增高不依賴于NF-κB通路
　　 加入核因子-κB抑制因子激酶(IKK)的抑制劑(SC514)可以阻斷IL-1β誘導(dǎo)的NF-κB由胞漿移入細(xì)胞核，但是它不能阻止IL-1β誘導(dǎo)的HMVECs單細(xì)胞層跨膜電阻降低，對(duì)辣根過(guò)氧化物酶的通透性增高以及細(xì)胞膜表面VE-cadherin減少。
　　

10、 在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中加入已知IL-1β激活的下游信號(hào)通路分子ERK1/2，p38和JNK的抑制劑可以分別阻斷各自的信號(hào)通路激活，但是它們都不能阻止IL-1β誘導(dǎo)的HMVECs的單細(xì)胞層對(duì)辣根過(guò)氧化物酶通透增加，跨膜電阻減低以及細(xì)胞表面VE-cadherin定位分布的減少。
　　 2.IL-1β破壞血管內(nèi)皮屏障功能，增加血管通透性，與IL-1β--MyD88-ARNO-Arf6-VE-cadherin的信號(hào)通路激活有關(guān)
　

11、　 通過(guò)Arf6pulldown實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在HMVECs中IL-1β可以迅速并持久的使Arf6GTP形式增加；在經(jīng)過(guò)Arf6RNA干涉處理的HMVECs中，Arf6表達(dá)降低，進(jìn)而檢測(cè)到在加入IL-1β刺激的HMVECs單細(xì)胞層較未處理者對(duì)辣根過(guò)氧化物酶通透性降低，細(xì)胞膜表面定位分布的VE-cadherin增加并且與未加IL-1β刺激者相比無(wú)顯著變化。
　　 在感染持續(xù)激活的Arf6基因片段的HMVECs中發(fā)現(xiàn)，激活的Arf6增

12、加促進(jìn)了單細(xì)胞層跨膜電阻的降低以及VE-cadherin在細(xì)胞膜的定位分布的減少。
　　 在HMVECs中加入ArfGAP抑制劑QS11，Arf6GTP形式顯著增加，QS11處理的HMVECs單細(xì)胞層較DMSO處理者的跨膜電阻的降低，對(duì)辣根過(guò)氧化物酶通透性增加，細(xì)胞膜表面定位分布的VE-cadherin減少并出現(xiàn)排列紊亂。
　　 cytohesins(GEF家族成員)的小分子抑制劑SecinH3處理HMVECs后發(fā)現(xiàn)，細(xì)

13、胞膜表面VE-cadherin在細(xì)胞膜表面的分布增加，并可以抑制IL-1β刺激引起的Arf6GTP形式增加，同時(shí)挽回IL-1β引起的單細(xì)胞層跨膜電阻的降低，阻止對(duì)辣根過(guò)氧化物酶通透性增加，穩(wěn)定細(xì)胞膜表面定位分布的VE-cadherin。
　　 經(jīng)過(guò)ARNO(GEF家族成員)RNA干涉的HMVECs，加入IL-1β不僅不能再引起Arf6GTP增加，而且阻止了處理組單細(xì)胞層在IL-1β刺激下對(duì)辣根過(guò)氧化物酶通透性改變以及細(xì)胞膜表面V

14、E-cadherin分布。
　　 利用siRNA干擾技術(shù)分別將白介素1受體已知下游通路的分子依次knockdown，發(fā)現(xiàn)siRNA干擾MyD88的表達(dá)可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的Arf6GTP增加并阻斷其誘導(dǎo)的對(duì)辣根過(guò)氧化物酶通透性增加，但是siRNA干擾IRAK表達(dá)不能做到這些。
　　 利用免疫共沉淀的方法，研究MyD88、ARNO全長(zhǎng)之間；MyD88各功能片段與ARNO全長(zhǎng)之間；ARNO各功能片段與MyD88全長(zhǎng)之間的關(guān)

15、系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，MyD88和ARNO之間有直接的相互連接。
　　 3.抑制Arf-GEFs可以降低CIA誘導(dǎo)的血管通透性和關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重性，MyD88-ARNO-Arf6通路可以作為類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療的有效靶點(diǎn)在標(biāo)準(zhǔn)的慢性炎性關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型即膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(CLA)中給予阻斷IL-1β-MyD88-ARNO-Arf6通路的Arf-GEFs的抑制劑SecinH3進(jìn)行治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SecinH3可以明顯抑制被CIA誘導(dǎo)的血管通透性增

16、加，關(guān)節(jié)炎的發(fā)展明顯減輕，表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)、血管翳生成、軟骨損傷和骨損傷都明顯減少。
　　 五、結(jié)論
　　 1.IL-1β誘導(dǎo)血管通透性的增高是不依賴于NF-κB通路的。
　　 2.IL-1β破壞血管內(nèi)皮屏障，增加血管通透性與IL-1β-MyD88-ARNO-Atf6-VE-cadherin的信號(hào)通路激活緊密相關(guān)。GAPs和GEFs可以通過(guò)調(diào)控Arf6的活化，影響血管內(nèi)皮通透性，其中ARNO是HMVECs中激活A(yù)r