生命早期營養(yǎng)不良誘導肺血管內皮細胞功能失調的表觀調控機制研究.pdf

1、生命早期（一般指胎兒期、嬰幼兒期）是生長發(fā)育的關鍵時期，這一階段正是機體各器官、組織、細胞分化形成和發(fā)育成熟時期;該階段可塑性強，多數(shù)器官和系統(tǒng)的發(fā)育在這個“時間窗”對環(huán)境敏感且易變，不良應激可導致疾病的發(fā)生和發(fā)展的易感性增強。
　　據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球每年出生1200多萬早產兒，占新生兒總數(shù)的9.6％。按照我國目前的出生率和早產發(fā)生率計算，每年出生約150萬早產兒，占全球早產兒總數(shù)的十分之一以上。宮外生長遲緩(Extraut

2、erine growth restriction，EUGR)指小兒出生后生長發(fā)育計量指標在相應宮內生長速率期望值的第10百分位水平以下（≤生長曲線的第10百分位）。EUGR在早產兒中發(fā)生率極高，問題十分突出。
　　大量的人群流行病學資料調查、前瞻性臨床研究和動物實驗研究結果表明，生命早期所處環(huán)境的不良刺激不僅影響出生前和出生后的生長發(fā)育，而且會對成年后的健康和生活質量產生遠期乃至終生影響，此即成人疾病的胎兒起源假說(fetal o

3、rigins of adult disease，F(xiàn)OAD)和“發(fā)育起源的健康與疾病”(developmentorigin of Health and disease,DOHaD)學說。
　　越來越多的證據(jù)揭示了表觀調控機制在發(fā)育起源的健康與疾病中起到重要作用。表觀遺傳學是研究不涉及DNA序列改變的基因表達和調控的可遺傳修飾，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、RNA干擾等。檢測DNA甲基化與組蛋白修飾的表觀遺傳學方法主要由染色質免疫沉淀

4、技術，以及在經過全基因組甲基化芯片芯片初步篩選后，Sequenom特定DNA段甲基化檢測技術對差異甲基化基因位點進行技術驗證。目前由于生命早期不良的營養(yǎng)環(huán)境相關的成人期肺部疾病發(fā)生的表觀遺傳調控機制已經有了初步的認識，然而，由生命早期營養(yǎng)受限所誘導的肺動脈高壓中是否存在表觀遺傳調控尚不清楚。
　　鑒于現(xiàn)有的資料，我們假設
　　1.生命早期營養(yǎng)受限可誘導肺血管功能相關的基因eNOS的表觀遺傳修飾的改變（DNA甲基化與組蛋白修飾

5、），并且可能存在性別的差異。
　　2.生命早期營養(yǎng)受限所致的成年期肺動脈高壓，存在著一系列相關基因的表觀遺傳修飾的改變。而且這些相關基因的早期表觀修飾改變可以引起個體成年期對外界刺激因素高度敏感，導致肺血管內皮細胞功能調控紊亂，從而發(fā)生肺動脈高壓。
　　這些表觀遺傳修飾改變可以引起個體對環(huán)境等刺激因素高度敏感，導致肺動脈高壓的發(fā)生。如果在個體發(fā)育早期階段給予適當?shù)母纱胧?，阻止或逆轉相關基因的表觀修飾，可能對降低成年后發(fā)生肺動

6、脈高壓有保護作用。
　　第一部分宮外生長遲緩改變肺血管內皮細胞eNOS的表達的表觀調控機制
　　目的:
　　大量的人群流行病學資料調查、前瞻性臨床研究和動物實驗研究結果表明，生命早期所處環(huán)境的不良刺激不僅影響出生前和出生后的生長發(fā)育，而且會對成年后的健康和生活質量產生遠期乃至終生影響。此即“發(fā)育起源的健康與疾病”(development origin of Health and disease，DOHaD)學說。目前生

7、命早期不良的營養(yǎng)環(huán)境相關的成人期疾病發(fā)生的表觀遺傳調控機制已經有了初步的認識，然而，由生命早期營養(yǎng)受限對肺血管內皮細胞的作用尚不清楚。肺血管內皮細胞由內皮型一氧化氮合成酶(eNOS)產生的一氧化氮(NO)在肺動脈高壓的發(fā)病中有重要作用，而內皮細胞eNOS的表達是受到表觀遺傳調控的。本研究的目的是探索在生命早期營養(yǎng)不良(EUGR)模型中肺血管內皮細胞中eNOS基因的表觀遺傳修飾的改變。
　　方法:
　　SD大鼠EUGR模型建立

8、，對哺乳期新生仔鼠進行飲食限制，制備EUGR模型。正常對照組飼養(yǎng)模式:10只仔鼠/窩;EUGR組喂養(yǎng)模式:20只仔鼠/窩。生后21天離乳的雌雄SD大鼠，磁珠激活的細胞分選技術(MACS)分離獲得肺血管內皮細胞(Pulmonary Vascular Endothelial Cell，PVEC)。Real-time PCR和Western blot用于檢測eNOS基因的mRNA和蛋白的表達水平;染色質免疫沉淀技術和Sequenom特定DNA

9、段甲基化檢測技術用于分析eNOS基因的組蛋白修飾和DNA甲基化的表觀調控機制的變化。
　　結果:
　　EUGR模型評估:EUGR組SD大鼠哺乳期生長速率明顯低于對照組，生后21天離乳時，體重與對照組相比明顯下降，降低30％左右。3周的EUGR組雌雄SD大鼠肺血管內皮細胞(PVEC)中，eNOS基因mRNA和蛋白水平明顯低于對照組;eNOS基因近端啟動子區(qū)域的組蛋白H3K9met3和H3K27met3水平均高于正常對照組，雄性

10、SD大鼠H3K27met3增加更明顯，有統(tǒng)計學差異;雌性EUGR組的eNOS基因啟動子DNA甲基化比對照組要高，有統(tǒng)計學差異;然而，雄性SD大鼠的eNOS基因啟動子DNA甲基化程度，兩組之間無顯著的統(tǒng)計學差異。
　　結論:
　　生命早期飲食受限的EUGR模型對SD大鼠肺血管內皮細胞中的eNOS基因的表達有影響。eNOS mRNA和蛋白表達減少與該基因啟動子區(qū)域的組蛋白“抑制性標記物”H3K27met3水平增加密切相關;雌性E

11、UGR組eNOS基因啟動子區(qū)域的DNA高甲基化可能與eNOS mRNA表達減少有關。eNOS基因的表觀修飾改變與減少的eNOS基因mRNA和蛋白水平相一致。表觀遺傳調控可能是EUGR模型中肺血管內皮細胞eNOS基因表達改變的機制之一，表觀遺傳調控的改變存在性別的差異。
　　第二部分宮外生長遲緩誘導成年期肺動脈高壓肺血管內皮細胞的表觀調控機制
　　目的:
　　生后早期是生長發(fā)育的關鍵時期，可塑性強，多數(shù)器官和系統(tǒng)的發(fā)育在

12、這個“時間窗”對環(huán)境敏感且易變，不良應激可導致疾病的發(fā)生和發(fā)展的易感性增強。生命早期營養(yǎng)不良不僅可以增加成年期代謝性疾病和心血管系統(tǒng)疾病的發(fā)病風險，還可以導致肺血管張力改變、肺血管重構，但引起肺血管功能失調的機制尚不十分清楚。EUGR在早產兒中發(fā)生率極高，問題十分突出。目前，生命早期營養(yǎng)受限相關的成人期疾病發(fā)生的表觀遺傳調控機制有了初步的認識，有研究推測相關基因的DNA甲基化與組蛋白修飾異?？赡軈⑴c生命早期營養(yǎng)干預導致的肺血管功能失調。

13、而且這些相關基因的早期表觀修飾改變可以引起個體成年期對等外界刺激因素高度敏感，導致肺血管張力調控紊亂，從而發(fā)生肺動脈高壓。本實驗的目的是為了探索EUGR導致的肺血管功能失調與DNA甲基化與組蛋白修飾異常改變的關系。
　　方法:
　　SD大鼠EUGR模型的建立。經右側頸外靜脈進行肺動脈插管，測量生后9周EUGR雄性大鼠肺動脈平均壓力。分離心臟組織，計算右心指數(shù)。對大鼠的肺組織進行免疫組化染色，評價肺血管重構情況。生后9周的雄S

14、D性大鼠，磁珠激活的細胞分選技術(MACS)分離獲得肺血管內皮細胞。Western blot用于評估eNOS蛋白的表達，Real-time RT-PCR技術用于驗證DNA甲基化異常調節(jié)基因的mRNA表達水平。染色質免疫沉淀技術用于分析eNOS、IGF-1、PPARγ基因的組蛋白修飾改變。對分選的PVECs進行全基因組DNA甲基化芯片(MeDIP)分析。Sequenom特定DNA段甲基化檢測技術對差異甲基化基因位點進行技術驗證。
　

15、　結果:
　　EUGR組雄性大鼠哺乳期到生后9周生長速率均低于對照組。9周SD雄性大鼠肺血管功能失調:肺動脈平均壓增高，右心指數(shù)數(shù)值增加，免疫組化結果肺小動脈發(fā)生重構。DNA甲基化芯片分析:篩選出來EUGR組與Control組之間DNA甲基化差異表達基因的近500多個。Gene Ontology分析:這些發(fā)生高甲基化水平改變的基因多與血管發(fā)育相關。這些發(fā)生低甲基化水平改變的基因與分化相關和參與信號轉導為主。DNA甲基化芯片結果顯示

16、Fgfr2、RhoC、Notch1呈高甲基化狀態(tài)，F(xiàn)gfr2、RhoC、Notch1三個基因的mRNA表達水平表達降低。eNOS、PPARγ、IGF-1基因的mRNA表達與DNA甲基化狀態(tài)和組蛋白修飾的改變有關。
　　結論
　　宮外生長遲緩(EUGR)模型雄性大鼠在成年期可出現(xiàn)肺血管功能失調，主要表現(xiàn)為肺動脈平均壓力增高，右心指數(shù)增加，肺血管重構。EUGR可導致成年期大鼠肺血管內皮細胞相關基因發(fā)生DNA甲基化異常改變。eNO