利用細菌array-CGH芯片比較牙齦卟啉單胞菌不同菌株的基因組差異.pdf

1、目的：
　　1.牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis, P.gingivalis）被認為是牙周炎最重要的可疑致病菌之一。多項研究證實，P.gingivalis不同菌株間存在一定的異質(zhì)性，使毒力特性存在差異。而鑒定病原菌的毒力株和毒力基因是研究微生物致病機制的重要手段。微陣列比較基因組雜交（ array comparative genomic hybridization, array-CGH）技術具有高分

2、辨率、高通量等優(yōu)點，不僅可以檢測基因組DNA拷貝數(shù)的差異，還能精確定位異常片段，便于篩選出毒力致病基因。本研究旨在構建 P.gingivalis全基因組規(guī)模的array-CGH芯片平臺，快速分析不同菌株間基因組的差異，為將來在分子水平上分析 P.gingivalis致病性差異的原因，尋找P. gingivalis致病性相關基因奠定基礎。
　　2.從不同牙周狀況人群的齦下菌斑中分離出 P.gingivalis，并進行培養(yǎng)和鑒定。為今

3、后利用array-CGH平臺，檢測不同毒力臨床菌株間基因組的差異，從分子水平上闡述牙周炎的發(fā)病機制奠定基礎。
　　方法：
　　1.綜合美國國立生物技術信息中心（ National Center For Biotechnology Information, NCBI）上公布的12株P.gingivalis菌的基因組序列信息，設計探針序列，定制芯片。提取P.gingivalis高毒力株W83和低毒力株ATCC33277的基因組D

4、NA，先用同一株菌的DNA進行自身雜交，以排除所構建array-CGH平臺的技術噪音，然后利用array-CGH技術檢測該兩株菌差異DNA片段，并篩選出部分差異基因，運用PCR驗證芯片結(jié)果的準確性。
　　2.選擇牙周健康者的健康位點，牙周炎患者的炎癥位點和健康位點，記錄探診出血指數(shù)（Bleeding on Probing, BOP），牙周探診深度（Probing Depth, PD），臨床附著喪失（Clinical Attachm

5、ent Loss, CAL）及牙齒松動度（Tooth Movement, TM）。刮取齦下菌斑，稀釋后接種于牛腦心浸出液培養(yǎng)（Barin Heart Infusion, BHI）培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)分離、傳代、增菌、16s rRNA PCR鑒定后收集菌體，提取DNA備用。
　　1.成功定制包含12株P.gingivalis全基因組序列分析后設計的芯片，低毒力株P.gingivalis ATCC33277自身DNA雜交沒有檢出大于2倍的

6、差異點，說明其技術噪音很低，芯片質(zhì)量合格。
　　2.不同毒力P.gingivalis菌的芯片雜交，不同于自身雜交中均一的黃色信號，呈現(xiàn)出紅綠混雜的熒光信號，提示兩株細菌存在多個差異基因。
　　3.使用R語言v3.1.1的limma軟件包提取芯片上每條探針的信息，經(jīng)兩菌株之間的比較分析，檢出了多個基因拷貝數(shù)的不同。其中，P.gingivalis W83的部分特異片段參與編碼毒力致病因子，ATCC33277部分特有片段的編碼蛋白

7、可增強細菌表明粘附性，使其具有高粘附力。
　　4.經(jīng)基本局部比對搜索工具（Basic local aligment search tool，BLAST）同源比對后，得到12個差異基因，進行PCR驗證，證實與芯片結(jié)果一致。
　　5.在牙周炎患者的齦下菌斑中成功分離得到10株臨床分離株，并進行16s rRNA PCR驗證，送測序證實卻為P.gingivalis。該10株菌的芯片比較基因組雜交分析將由后續(xù)的研究繼續(xù)完成。
　

8、　結(jié)論：
　　1. array-CGH技術在快速檢測P.gingivalis基因組DNA拷貝數(shù)的差異，定位異常片段中有明顯的優(yōu)勢，可用于篩選毒力致病基因。
　　2.本研究成功構建了利用 array-CGH技術檢測牙齦卟啉單胞菌不同毒力株基因差異的平臺，為在分子水平上分析P.gingivalis致病差異的原因奠定基礎。
　　3.已熟練掌握 P.gingivalis的分離鑒定方法，并成功分離培養(yǎng)出10株P.gingival