新型隱球酵母檸檬酸合成酶在致病性中的作用.pdf

1、新型隱球酵母(Cryptococcus neoformans)是產(chǎn)莢膜擔(dān)子菌,主要通過(guò)鳥的糞便,土壤腐生物等在自然界傳播,經(jīng)過(guò)呼吸道,感染有免疫缺陷的病人,如：艾滋病患者,器官移植后接受免疫抑制治療的患者和接受大量固醇藥物治療的人群,并導(dǎo)致腦膜炎等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病,嚴(yán)重者危及生命。盡管如此,目前還沒(méi)有治療新型隱球酵母感染的特效藥,并且患者需要終身用藥。現(xiàn)在臨床上多使用兩性霉素B,氟氫可的松以及氟康唑,但這些藥物的毒副作用非常明顯,并且不

2、斷出現(xiàn)藥物耐受反應(yīng),所以隱球酵母感染很難治愈。目前為止,普遍認(rèn)為新型隱球酵母致病性主要與以下三個(gè)因素有關(guān)：37℃條件下能夠生長(zhǎng)的能力,合成多糖莢膜以及產(chǎn)生多酚氧化酶——漆酶。 根瘤農(nóng)桿菌(Agrobaterium tumefaciens)是一種革蘭氏陰性細(xì)菌,主要用于介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化,同樣此方法也適用于介導(dǎo)新型隱球酵母的轉(zhuǎn)化。通過(guò)農(nóng)桿菌和酵母細(xì)胞的接合作用, T-DNA隨機(jī)插入整合到酵母基因組中。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的新型隱球酵母轉(zhuǎn)化較電轉(zhuǎn)化

3、,基因槍轉(zhuǎn)化有其自身優(yōu)點(diǎn)：1.轉(zhuǎn)化效率高,轉(zhuǎn)化材料簡(jiǎn)單易得；2.轉(zhuǎn)化子穩(wěn)定；3.轉(zhuǎn)化子中單拷貝插入現(xiàn)象普遍,易于進(jìn)行基因分析。漆酶是新型隱球酵母的主要致病因子,它為含銅多酚氧化酶,能夠氧化兒茶酚等合適的底物生成黑色素,高葡萄糖濃度抑制漆酶的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)新型隱球酵母轉(zhuǎn)化的方法,以及漆酶可以氧化多酚底物(去甲腎上腺素,NE)生成黑色素這一表型,在抑制漆酶表達(dá)的培養(yǎng)基上(4％Asn,加入NE至終濃度為0.1 mg/ml)篩選

4、漆酶去葡萄糖阻遏突變株,從而進(jìn)一步克隆得到突變基因。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)此方法,得到一株去葡萄糖阻遏表達(dá)漆酶的突變株(T-DNA單拷貝插入),并通過(guò)反向PCR成功獲得該突變基因。該基因編碼檸檬酸合成酶(Citrate Synthase,CS),記為CIT1。相應(yīng)的突變菌株被命名為Δcit,回補(bǔ)菌株為Δcit::CIT。 三羧酸循環(huán)(TCA)是酵母細(xì)胞產(chǎn)生能量的重要代謝途徑,其主要功能是產(chǎn)生能源分子ATP和細(xì)胞物質(zhì)代謝的眾多分子前體,對(duì)于維

5、持酵母生存及其他生命活動(dòng)至關(guān)重要。檸檬酸合成酶則是該反應(yīng)中的限速酶,催化乙酰-CoA和草酰乙酸反應(yīng)合成檸檬酸,是三羧酸循環(huán)的重要調(diào)節(jié)點(diǎn),直接影響三羧酸循環(huán)的進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)對(duì)該檸檬酸合成酶突變株(Δcit)的生長(zhǎng)表型進(jìn)行了檢測(cè)：發(fā)現(xiàn)其在多種碳源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)緩慢,形成與野生型相比較小的菌落；發(fā)現(xiàn)該突變菌株細(xì)胞容易聚集；其對(duì)抗高溫,高堿等壓力條件的能力也明顯減弱。在致病因子方面：多糖莢膜變?。辉诖笥?％濃度的葡萄糖培養(yǎng)基漆酶去阻遏,產(chǎn)生黑色素；