siRNA沉默EC109細(xì)胞中腫瘤壞死因子受體1對細(xì)胞增殖和凋亡的影響.pdf

1、目的:
　　腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor1,TNFR1)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)的膜受體之一。TNFR1在人體內(nèi)廣泛分布于正常細(xì)胞膜表面,也存在于多種腫瘤細(xì)胞表面。TNFR1與配體TNF-α或TNF-β結(jié)合后,啟動相關(guān)的信號通路,功能涉及到細(xì)胞的活化、增殖、凋亡及細(xì)胞毒活性等方面,但在不同的細(xì)胞,可以出現(xiàn)相反的結(jié)果,其作用機(jī)制目前尚不完

2、全清楚。RNA干擾(RNA interference,RNAi)技術(shù)是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-stranded RNA,dsRNA)引發(fā)的普遍存在于生物體中的序列特異性基因轉(zhuǎn)錄后沉默過程,越來越廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)實(shí)驗研究。本研究主要應(yīng)用RNAi的實(shí)驗方法,沉默食管癌細(xì)胞系EC109中TNFR1的表達(dá),隨后探討對照組與實(shí)驗組細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為的變化。
　　材料和方法:
　　1. EC109細(xì)胞用DM

3、EM+F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)傳代,RNAiso Reagent提取細(xì)胞總RNA, RT-PCR檢測細(xì)胞中TNFR1在基因水平的表達(dá)。EC109細(xì)胞用DMEM+F12培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)傳代,胰酶消化后收集貼壁生長的細(xì)胞,PBS清洗、離心、裂解,試劑盒分級提取可溶性亞細(xì)胞蛋白組分,所得膜蛋白進(jìn)行Western Blot分析,檢測EC109中TNFR1在蛋白水平的表達(dá)。
　　2. EC109細(xì)胞用DMEM+F12培養(yǎng)基在六孔板內(nèi)培養(yǎng),在對轉(zhuǎn)染

4、條件進(jìn)行優(yōu)化后,對細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染,細(xì)胞分三組:空白對照組(未加轉(zhuǎn)染試劑及 siRNA),陰性對照組(加入轉(zhuǎn)染試劑及陰性對照siRNA),實(shí)驗組(加入轉(zhuǎn)染試劑及TNFR1-siRNA)。RNAiso Reagent消化細(xì)胞后提取各組細(xì)胞總RNA,RT-PCR檢驗基因水平轉(zhuǎn)染效果。試劑盒分級提取可溶性亞細(xì)胞蛋白組分,Western Blot技術(shù)檢驗蛋白水平轉(zhuǎn)染效果。
　　3.轉(zhuǎn)染24小時后倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。
　　4.將E

5、C109細(xì)胞種于96孔板,對轉(zhuǎn)染條件進(jìn)行優(yōu)化,細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞增殖能力的改變,繪制細(xì)胞生長曲線。
　　5.收集轉(zhuǎn)染后六孔板中各組細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡的變化情況。
　　結(jié)果:
　　1.由RT-PCR以及Western Blot等手段驗證TNFR1在食管癌細(xì)胞系EC109中高表達(dá)。
　　2.將TNFR1-siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)EC109細(xì)胞中,成功封閉了TNFR1的表達(dá)。

6、r>　　3. RNAi處理后,三組細(xì)胞在形態(tài)上沒有顯示差別;RNAi處理后MTT檢測結(jié)果顯示,空白對照組和陰性對照組的細(xì)胞32小時內(nèi)的細(xì)胞增殖沒有差異(P>0.05),實(shí)驗組的細(xì)胞增殖加快(P<0.05);RNAi處理后空白對照組和陰性對照組的細(xì)胞凋亡情況無差異(P>0.05),實(shí)驗組的細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)。
　　結(jié)論:
　　1. TNFR1在食管癌細(xì)胞系EC109中高表達(dá)。
　　2.阻斷TNFR1的表達(dá)使食