桿狀病毒-腺相關(guān)病毒融合病毒介導(dǎo)核素報(bào)告基因監(jiān)測(cè)干細(xì)胞移植的研究.pdf

1、目的：在活體條件下實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)和定量的干細(xì)胞監(jiān)測(cè)對(duì)優(yōu)化干細(xì)胞移植治療具有重要意義。本研究通過構(gòu)建和制備新型的桿狀病毒(BV)-腺相關(guān)病毒(AAV)融合病毒(BV-AAV)，探討以此作為轉(zhuǎn)基因載體介導(dǎo)核素報(bào)告基因進(jìn)行干細(xì)胞移植監(jiān)測(cè)的可行性，并進(jìn)一步利用睡美人轉(zhuǎn)座子基因(SB100×)改良BV，評(píng)估其介導(dǎo)報(bào)告基因進(jìn)行長(zhǎng)期顯像的潛力。
　　方法：將增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(eGFP)報(bào)告基因或人鈉碘同向轉(zhuǎn)運(yùn)體(hNIS)報(bào)告基因，構(gòu)建于一組AAV

2、來源的末端反向重復(fù)序列(ITRs)之間，以此制備BV-AAV(分別命名為BIeV和BIhV)。利用BIeV感染大鼠骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(rBM-MSCs)和人臍帶血來源的間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)等多種干細(xì)胞，測(cè)定感染效率、轉(zhuǎn)基因表達(dá)水平和持續(xù)時(shí)間，以及對(duì)干細(xì)胞的細(xì)胞毒性/增殖的影響等。在對(duì) BIhV感染的干細(xì)胞攝取125I?的特性進(jìn)行體外研究后，將感染的干細(xì)胞移植入裸鼠體內(nèi)進(jìn)行hNIS核素報(bào)告基因顯像。在此基礎(chǔ)上引入SB10

3、0×以改良BV，利用含不同結(jié)構(gòu)的BV感染腫瘤細(xì)胞，經(jīng)體外對(duì)比實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)SB100×延長(zhǎng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間的功能，并進(jìn)一步分別利用含 eGFP或胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)報(bào)告基因的SB100×改良BV病毒(BSeNV或BSGNV)介導(dǎo)報(bào)告基因進(jìn)行腫瘤細(xì)胞移植后的長(zhǎng)期顯像研究；同時(shí)利用含GLP-1R報(bào)告基因的BV-AAV(BIGV)感染hUCB-MSCs，并進(jìn)行移植后的報(bào)告基因顯像監(jiān)測(cè)。
　　結(jié)果：通過桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)可較快速

4、地制備高滴度病毒(均在108 pfu/mL以上)。體外研究顯示，BIeV感染rBM-MSCs和hUCB-MSCs后，介導(dǎo)表達(dá)eGFP的陽(yáng)性細(xì)胞比例(eGFP+%)在病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)為200時(shí)分別可達(dá)到84.25±1.38%和76.73±3.75%，eGFP+%分別在19 d或11 d內(nèi)逐漸降至10%以下，且BV-AAV對(duì)兩者的感染未表現(xiàn)出細(xì)胞毒性和對(duì)細(xì)胞增殖的影響。BIhV感染的rBM-MSCs和hUCB-MSCs均可在體外攝取1

5、25I－，且均在30 min達(dá)到攝取最高峰，該125I－攝取可被高氯酸鈉抑制。此外，體外相關(guān)性研究顯示BIhV感染的干細(xì)胞數(shù)量與其攝取的125I?放射性計(jì)數(shù)呈顯著的相關(guān)性(分別為R2=0.9026和R2=0.9940)。經(jīng)125I?顯像劑和小動(dòng)物micro-SPECT/CT顯像表明，BIhV感染的兩類干細(xì)胞移植部位均清晰顯像，靶/本比高，移植部位放射性信號(hào)在120 min內(nèi)逐漸降低。進(jìn)一步構(gòu)建和制備含不同結(jié)構(gòu)的BV并感染腫瘤細(xì)胞(FTC

6、-133細(xì)胞和 U87細(xì)胞)，通過流式細(xì)胞術(shù)等方法對(duì)比研究表明，經(jīng) SB100×改良 BV感染和藥物篩選獲得的腫瘤細(xì)胞系(FTC-133-eN細(xì)胞和U87-eN細(xì)胞)可表達(dá)eGFP達(dá)180 d；將U87-eN細(xì)胞移植入裸鼠后的小動(dòng)物熒光顯像表明，移植部位的細(xì)胞可通過eGFP報(bào)告基因顯像進(jìn)行35 d的長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)；將篩選獲得的穩(wěn)定表達(dá) GLP-1R的腫瘤細(xì)胞系(FTC-133-GN細(xì)胞)移植入裸鼠后，經(jīng)[18F]AlF-NOTA-MAL-Cy

7、s39-exendin-4顯像劑和小動(dòng)物micro-PET顯像同樣獲得50 d的GLP-1R報(bào)告基因顯像監(jiān)測(cè)，腫瘤移植部位清晰顯像，靶/本比高，顯像劑注射后120 min內(nèi)未見明顯的腫瘤移植部位放射性信號(hào)降低；同時(shí)，利用攜帶GLP-1R報(bào)告基因的BV-AAV(BIGV)感染hUCB-MSCs，移植后進(jìn)行小動(dòng)物micro-PET顯像同樣可見較理想的顯像效果。
　　結(jié)論：BV-AAV對(duì)rBM-MSCs和hUCB-MSCs的感染效率較高