團(tuán)頭魴β--防御素1對巨噬細(xì)胞趨化效應(yīng)研究.pdf

1、β-防御素(3-defensin，BD)是一種富含半胱氨酸具有廣譜抗菌活性的陽離子短肽。目前研究發(fā)現(xiàn)，BD可以趨化免疫細(xì)胞遷移，在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究通過對團(tuán)頭魴β-防御素1(MaBDl)進(jìn)行表達(dá)和純化，獲得團(tuán)頭魴β-防御素1重組蛋白，研究其對團(tuán)頭魴白細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞的趨化作用和炎癥細(xì)胞因子表達(dá)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建原核重組表達(dá)載體pET-32a-MaBD1，通過IPTG誘導(dǎo)表達(dá)MaBD1重組融合蛋

2、白。將該蛋白利用Ni2+親和層析方法純化后，再經(jīng)腸激酶酶切及純化，獲得MaBD1重組蛋白。使用MaBD1重組蛋白進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示MaBD1重組蛋白對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌活性。
　　2.采用Percoll非連續(xù)梯度離心法分離團(tuán)頭魴頭腎白細(xì)胞，再利用貼壁方法分離純化巨噬細(xì)胞，采用光鏡和透射電子顯微鏡進(jìn)行鑒定，結(jié)果顯示:團(tuán)頭魴頭腎白細(xì)胞主要包括:中性粒細(xì)胞、單核/巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞。貼壁巨噬細(xì)胞鋪展

3、或伸長呈各種形狀，細(xì)胞核圓形和橢圓形，多數(shù)偏于細(xì)胞一側(cè)。巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志CD68在貼壁巨噬細(xì)胞中高表達(dá)。
　　3.用Transwell法檢測MaBD1的體外趨化活性，發(fā)現(xiàn)MaBD1重組蛋白對白細(xì)胞，尤其是巨噬細(xì)胞具有明顯趨化作用。為進(jìn)一步了解MaBD1趨化功能位點(diǎn)，分別合成N端(MaBDPl)和C端(MaBDP2)MaBD1多肽，N端的趨化活性顯著高于C端。
　　4.將MaBDPl注射團(tuán)頭魴腹腔，觀察MaBDP1對體內(nèi)白細(xì)胞

4、以及巨噬細(xì)胞趨化活性，結(jié)果顯示MaBDP1對體內(nèi)白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞都有趨化作用。在2d500ng/mL MaBDP1對白細(xì)胞具有趨化作用。而在3d1000ng/mL MaBDP1對巨噬細(xì)胞趨化作用明顯。qPCR檢測MaBDP1對促炎細(xì)胞因子（IL-1β和TNF-α）表達(dá)影響結(jié)果顯示:脾臟，頭腎和體腎中IL-1β表達(dá)量在6h和72h表達(dá)量顯著升高，肝胰腺中IL-1β表達(dá)量在6h表達(dá)量顯著升高;脾臟，頭腎和體腎中TNF-α表達(dá)量在72h顯著升