UCA1在結(jié)直腸癌中表達(dá)及功能研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分：UCA1在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)研究
　　目的:
　　在結(jié)直腸癌組織中檢測尿路上皮癌相關(guān)基因1(Urothelial carcinomaassociated1，UCA1)的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理因素和預(yù)后的關(guān)系。
　　方法:
　　實(shí)時RT-PCR技術(shù)檢測結(jié)直腸癌組織中UCA1的表達(dá)水平，比較結(jié)直腸癌組織及其配對正常組織中UCA1的表達(dá)差異。分別收集并整理90

2、例病例的臨床病理信息及預(yù)后資料，首先通過Logistic回歸分析UCA1表達(dá)水平對臨床病理因素的影響。接下來采用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，Log-Rank方法比較UCA1高表達(dá)組和低表達(dá)組之間的生存率，最后采用Cox比例風(fēng)險模型進(jìn)行多因素分析，以確定在多因素作用下UCA1對預(yù)后的影響。
　　結(jié)果:
　　檢測90例結(jié)直腸癌組織及其配對正常組織中UCA1的表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)UCA1在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.

3、01)，有約59％左右的結(jié)直腸癌組織中UCA1表達(dá)上調(diào)2倍以上。UCA1高表達(dá)患者表現(xiàn)出更差的預(yù)后(P=0.0026)，且結(jié)直腸癌腫瘤組織中UCA1的高表達(dá)與腫瘤大小(P=0.010)，腫瘤浸潤深度（P=0.041）及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.035)呈正相關(guān)。UCA1（HR=2.395，95％ CI=1.044-5.495，P=0.039）和腫瘤轉(zhuǎn)移（HR=3.004，95％ CI=1.310-6.899，P=0.009）是結(jié)直腸癌患者生存

4、的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　結(jié)論:
　　UCA1在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，并與病床病理因素及預(yù)后相關(guān)。UCA1是結(jié)直腸癌患者生存的獨(dú)立預(yù)后因素。
　　第二部分：UCA1在結(jié)直腸癌中的功能研究
　　目的:
　　在體外細(xì)胞水平明確UCA1對于結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡、耐藥等生物學(xué)表型的影響。同時在體內(nèi)動物水平驗(yàn)證UCA1對于腫瘤形成的影響。
　　方法:
　　通過CCK-8和克隆形成，探討UCA

5、1過表達(dá)或表達(dá)抑制后對結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖能力及5-FU耐藥的影響。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測UCA1對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響。構(gòu)建裸鼠成瘤模型探討UCA1在體內(nèi)對結(jié)直腸癌細(xì)胞成瘤能力的影響。
　　結(jié)果:
　　沉默UCA1表達(dá)后細(xì)胞的增殖能力明顯降低;而過表達(dá)UCA1后細(xì)胞的增殖能力明顯增加。克隆形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)UCA1能夠增加結(jié)直腸癌細(xì)胞克隆形成能力。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)證明沉默UCA1能夠抑制結(jié)直腸癌體內(nèi)細(xì)胞增殖;過表達(dá)UCA1能夠促進(jìn)結(jié)直腸

6、癌體內(nèi)細(xì)胞增殖。在UCA1敲降的和過表達(dá)的細(xì)胞中，加入不同濃度的5-FU（0.5、1.0、2.0、4.0、10.0和50.0μg/mL）。48小時后通過CCK-8測定細(xì)胞活性，可見敲降UCA1能夠明顯增加HCT116細(xì)胞對5-FU的藥物敏感性;過表達(dá)UCA1能夠明顯降低SW480細(xì)胞對5-FU的藥物敏感性。通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡情況，可見敲降UCA1能夠明顯增加凋亡細(xì)胞比例;而過表達(dá)UCA1能夠明顯降低凋亡細(xì)胞比例。
　　結(jié)論

7、:
　　UCA1能夠促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞體外和體內(nèi)的細(xì)胞增殖。UCA1能夠通過減少凋亡降低結(jié)直腸癌細(xì)胞對5-FU的藥物敏感性。
　　第三部分：UCA1促癌機(jī)制研究
　　目的:
　　在結(jié)直腸癌組織中探討UCA1通過何種機(jī)制促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及對5-FU耐藥。
　　方法:
　　雙熒光素酶激活實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證UCA1和miR-204-5p是否通過MRE相結(jié)合。RNA免疫沉淀法(RNA immunoprecipitatio

8、n，RIP)利用Ago2抗體捕獲Ago2蛋白及與其結(jié)合的RNA，然后通過實(shí)時RT-PCR的方法檢測UCA1和miR-204-5p的含量。雙熒光素酶激活實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證CREB1是否是miR-204-5p的靶基因。雙熒光素酶激活實(shí)驗(yàn)和Western blot驗(yàn)證UCA1對miR-204-5p的靶基因（CREB1、BCL2和RAB22A）的表達(dá)調(diào)控。最后通過免疫組化檢測CREB1在CRC組織中的表達(dá)及與預(yù)后的關(guān)系。
　　結(jié)果:
　　雙熒

9、光素酶激活實(shí)驗(yàn)和RNA免疫沉淀證實(shí)miR-204-5p能夠和UCA1通過miRNA的核糖核蛋白復(fù)合物中的Ago2蛋白相結(jié)合。UCA1能夠通過海綿吸附miR-204-5p上調(diào)其靶基因（CREB1、BCL2和RAB22A）的表達(dá)。我們還發(fā)現(xiàn)CREB1作為miR-204-5p的一個新的靶基因在結(jié)直腸癌中表達(dá)上調(diào)并與患者不良預(yù)后相關(guān)。
　　結(jié)論:
　　UCA1能夠通過海綿吸附miR-204-5p上調(diào)其靶基因(CREB1、BCL2和R