周期性動態(tài)壓縮應力對條件性敲除Ihh基因軟骨細胞立體培養(yǎng)力學—生物學特性的分析.pdf

1、目的：
　　利用Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl基因工程小鼠所培育的未成熟的小鼠的肋軟骨細胞，使用周期性動態(tài)壓縮應力（Flexcell-5000施加正弦波、0.5Hz、5kPa、1h/d壓縮應力）的方法探討條件性敲除Ihh基因后的軟骨細胞立體培養(yǎng)的力學生物學特性。
　　方法：
　　1.基因工程小鼠（Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl和Ihhfl/fl）的培育及其基因鑒定。
　　2.取剛出

2、生的基因工程小鼠（攜帶Ihhfl/fl純合基因并且具有Col2a1-CreERT2基因）40只。隨機的分為實驗組和對照組，實驗組基因小鼠給予腹腔連續(xù)注射3天 TM（Tamoxifen），對照組基因小鼠給予腹腔連續(xù)注射3天等量植物油，待第6天時取小鼠肋軟骨，急性消化肋軟骨細胞作為本實驗的細胞來源。
　　3.用實時熒光定量PCR技術(shù)來檢測 Ihh基因相對表達量，計算 Ihh基因的敲除率。
　　4.將實驗組與對照組急性消化分離的細

3、胞以2×105/ml的密度混于1.5％的海藻酸鈉凝膠中，利用模型制成海藻酸鈉細胞盤。實驗組與對照組各自分為兩組：其中一組海藻酸鈉細胞盤用 Flexcell-5000基底加載系統(tǒng)施加動態(tài)壓縮應力(正弦波、0.5Hz、5kPa、1h/d)7、14、21天；另一組海藻酸鈉細胞盤靜態(tài)培養(yǎng)7、14、21天。
　　5.分別在7、14、21天時在倒置顯微鏡下觀察各組軟骨細胞的生長狀況。
　　6.通過RT-PCR技術(shù)測定同一時間點的實驗組和

4、對照組內(nèi)細胞盤的Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、蛋白多糖（AGG）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）mRNA的相對表達量。
　　7.運用半無限體細胞力學模型與微管吸吮技術(shù)相結(jié)合來測定各組內(nèi)不同時間點的細胞力學特性。
　　結(jié)果：
　　1.通過RT-PCR檢測Ihh基因相對表達量發(fā)現(xiàn)：實驗組基因小鼠在腹腔注射TM（Tamoxifen）后與對照組相比其Ihh基因相對表達量降低（P<0.01）。對Ihh信號通路的下游基因Gli-1的相對

5、表達量進行檢測發(fā)現(xiàn)：實驗組Gli-1基因表達降低（P<0.01）（圖1）。敲除效率約為64%。
　　2.同一時間點，壓縮刺激可以促進軟骨細胞在海藻酸鈉凝膠中的增殖，倒置顯微鏡觀察細胞盤發(fā)現(xiàn)：實驗組、對照組內(nèi)壓縮細胞盤的細胞密度隨著壓縮刺激天數(shù)的增長而增加，其密度明顯高于同組內(nèi)靜態(tài)培養(yǎng)組；實驗組(基因敲除)與對照組(未敲除)相比：敲除Ihh后的軟骨細胞盤與未敲除Ihh的軟骨細胞盤中的細胞密度相差不明顯。
　　3.RT-PCR檢

6、測：（1）實驗組(基因敲除)與對照組(未敲除)立體培養(yǎng)細胞盤相比、壓縮細胞盤相比：7天時,實驗組的AGG、Col II相對表達量增高(P<0.05)；實驗組內(nèi)、對照組內(nèi)的壓縮細胞盤與立體培養(yǎng)細胞盤相比：壓縮7天AGG、Col II相對表達量增高(P<0.05)；各組內(nèi)不同時間點AGG、Col II相對表達量對比：壓縮組7天表達量高于14天、21天(P<0.05)；（2）實驗組(基因敲除)與對照組(未敲除)中立體培養(yǎng)細胞盤相比、壓縮細胞盤

7、相比：實驗組的內(nèi)各時間點ColⅩ、MMP-13的相對表達量較對照組內(nèi)各時間點的相對表達量均降低，其中7天、21天實驗組的表達水平降低明顯(P<0.05)；實驗組內(nèi)、對照組內(nèi)的壓縮細胞盤與立體培養(yǎng)細胞盤相比：壓縮14天時ColⅩ、MMP-13的相對表達量增高(P<0.05)；各組內(nèi)不同時間點對比：壓縮組14天ColⅩ、MMP-13的相對表達量高于7天、21天(P<0.05)。
　　4.各組內(nèi)細胞瞬時模量（E0）、平衡模量（E∞）、表

8、觀黏性（μ）隨著培養(yǎng)時間的增加而降低，其中實驗組、對照組內(nèi)壓縮21天的E0、E∞、μ明顯低于同組內(nèi)壓縮7、14天（P＜0.05），7天與14天之間無統(tǒng)計學差異；實驗組與對照組相比較，在同一時間點實驗組立體培養(yǎng)軟骨細胞、動態(tài)壓縮的軟骨細胞的E0、E∞、μ均大于對照組，其中實驗組內(nèi)壓縮21天的E0、E∞明顯高于對照組內(nèi)壓縮21天（P＜0.05）；實驗組內(nèi)與對照組內(nèi)同一時間點的動態(tài)壓縮軟骨細胞的E0、E∞、μ均大于立體培養(yǎng)軟骨細胞的E0、E∞